三黄鸡CD154基因的克隆、序列分析与表达

• 作者: 方亮 方六荣 李彬 江云波 肖少波 袁明涛 陈焕春 马朝志
• 来源期刊: 畜牧兽医学报
• 学科: 农学
• 关键词: 鸡 CD154 克隆 表达 定位
• 年，卷（期）: 2007,（10）
• 所属期刊栏目: 遗传繁育
• 页码范围: 1032-1037
• 页数: 6页
• 分类号: S831.2
• 字数: 4312字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:0366-6964.2007.10.005

摘要

CD154在抗原特异的T淋巴细胞和抗原提呈细胞的相互作用中发挥非常重要的作用.利用RT-PCR方法从三黄鸡的外周血单核细胞(PBMC)中克隆了鸡CD154基因全长cDNA,序列分析显示该基因cDNA全长819 bp,可编码272个氨基酸.将克隆的鸡CD154全长cDNA克隆到原核表达载体pET-28a中获得表达质粒pET-28a-CD154,转化BL21(DE3)后未检测到特异性表达蛋白.进一步通过PCR获得去除信号肽(1～22 aa)和跨膜区(23～46 aa)的CD154基因片段(CD154d),并将其克隆到pQE80的6×His下游,在大肠杆菌中成功表达,获得分子量约27 ku的融合表达蛋白6×His-CD154d.Western-blot试验证实表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应.同时,将CD154基因全长cDNA插入真核表达载体pEGFP-C1的EGFP基因下游,获得真核表达质粒pEGFP-CD154,转染Hela细胞,荧光显微镜观察发现EGFP-CD154融合蛋白表达在细胞膜上,证实了鸡CD154的膜定位特性.本研究为进一步研究鸡CD154的结构与功能及其免疫佐剂效应奠定了基础.