心脏连接蛋白43羧基末端相互作用蛋白的酵母双杂交筛选

• 作者: 李玉光 林吉进 梁庆
• 来源期刊: 心脏杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 缝隙连接通道 连接蛋白43 心律失常 蛋白质-蛋白质相互作用
• 年，卷（期）: 2007,（3）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 280-285
• 页数: 6页
• 分类号: R541.7
• 字数: 5413字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1009-7236.2007.03.010

摘要

目的 研究心脏连接蛋白43(Cx43)羧基末端与哪些心肌细胞内蛋白质存在相互作用.方法①通过PCR方法得到编码心脏Cx43羧基末端(AA235-382)的cDNA片段,并在其两端分别加上EcoRI和BamHI酶切位点,应用EcoRI/BamHI酶切PCR产物及pGBKT7空载体,凝胶分离后应用T4连接酶进行连接; ②通过化学转化法将pGBKT7-Cx43-CT转化酵母菌A H109; ③通过"尿素/SDS " 法从被转化的酵母菌中提取蛋白质; ④应用抗C-myc抗体,通过Western blot方法检测"诱饵"蛋白的表达(即Gal4-BD-C-myc-Cx43-CT融合蛋白); ⑤检测"诱饵"蛋白自我激活报告基因与否后,将已被"诱饵"质粒转化的AH109与人心脏cDNA文库进行杂交,筛选阳性克隆分离阳性克隆中的cDNA,并测序.结果①诱饵载体测序结果证明pGBKT7中的"Gal4 DNA binding domain-C-myc"与Cx43的羧基末端在同一读框中; ②"诱饵"质粒转化AH109酵母菌成功率100%; ③从被转化的AH109中能提取到浓度满意的总蛋白; ④Western blot 能检测到特异性条带,其位置与Gal4-BD-C-myc-Cx43-CT的分子量相当; ⑤"诱饵"蛋白不能自激活报告基因Ade2和Mel1,但可自激活His3, 5 mmol/L的3-AT可有效抑制"诱饵"蛋白本身自激活报告基因His3,以利于下一步的杂交筛选,筛选得到10个准阳性克隆.结论心脏连接蛋白43羧基末端能与心肌细胞中的多种蛋白质存在相互作用, 这些蛋白质可能参与对间隙连接通道的功能调控.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	李玉光	汕头大学医学院第一附属医院心内科	125	725	14.0	21.0
2	林吉进	汕头大学医学院第一附属医院心内科	25	181	8.0	12.0
3	梁庆	汕头大学医学院第一附属医院心内科	5	60	4.0	5.0