构建双突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体的实验

• 作者: 吴平生 王月刚 胡英芳 谢宜军 赖文岩 赖艳娴
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 低氧诱导因子 冠状动脉粥样硬化性心脏病 基因治疗 腺病毒载体
• 年，卷（期）: 2007,（33）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 6565-6568
• 页数: 4页
• 分类号: R541.4
• 字数: 4350字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2007.33.024

摘要

目的:前期实验已成功构建无突变及564位是单突变腺病毒载体.在此基础上构建人双突变型低氧诱导因子1α腺病毒表达载体,为进一步研究低氧诱导因子1α基因及其突变体的临床应用奠定基础.方法:实验于2005-12/2006-12在南方医院心内科重点实验室完成.①实验材料:限制性内切酶Pacl(NEB),PI-Scel、I-Ceul(Clontech);IPTG、C-Gal(Takara),转染试剂Lipofectamine2000(Invitrogen),凝胶回收试剂盒(Omega);DMEM(Omega);小牛血清(PAA);北京天为时代公司病毒基因组提取试剂盒;HIF-1α单克隆抗体(Chemicon International公司);羊抗鼠辣根过氧化物酶标记二抗(北京鼎国生物公司).质粒、菌珠、细胞系等:Adeno-XTM-Adenoviral Expression Systems(BD.CLONTECH):包括有pShuttle2、pShuttle2-lacZ、Adeno-XTM Viral DNA等;重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala564-Ala803及pShuttle2-lacZ(本室已构建成功);大肠杆菌DH5α(本室保存);HEK293A细胞(中科院上海细胞所).②实验方法:采用分子克隆技术,以Pl-Scel和I-Ceul双酶切重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala564-Ala803,然后切下含有低氧诱导因子1αcDNA表达的盒片段,通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒Adeno-X Viral DNA连接,重组成pAdeno-HIF-1α腺病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,在HEK293A细胞中包装成为重组腺病毒Adeno-HIF-1α-Ala564-Ala803.③实验评估:进行PCR鉴定及滴度测定.用重组腺病毒转染293A,采用Westernblot鉴定低氧诱导因子1α蛋白表达.结果:提取重组腺病毒质粒pAdeno-HIF-1α-Ala564-Ala803以引物A、B和引物1、2、3、4进行PCR鉴定,分别扩增出287,460,214bp的3种引物片段,与预期一致,经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功.pAdeno-lacZ转染293A细胞后X-Gal原位染色,显示约有近20%左右细胞染成蓝色,病毒滴度为6.8×107 pfu/mL.Adeno-HIF-1α-Ala564-Ala803转染293A后稳定表达低氧诱导因子1α蛋白.结论:成功构建了重组腺病毒突变型的Adeno-HIF-1α-Ala564-Ala803.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	赖文岩	南方医科大学南方医院心内科	112	677	13.0	19.0
2	吴平生	南方医科大学南方医院心内科	131	614	13.0	18.0
3	王月刚	南方医科大学南方医院心内科	48	237	8.0	12.0
4	谢宜军	南方医科大学南方医院心内科	9	33	3.0	5.0
5	胡英芳	南方医科大学南方医院心内科	8	32	4.0	5.0
6	赖艳娴	南方医科大学南方医院心内科	5	25	3.0	5.0