小鼠睾丸组织特异基因RNA干扰载体的构建及其表达的研究

• 作者: 李兆阳 杨葳 王惟 董婉维 郑志红
• 来源期刊: 实验动物与比较医学
• 学科: 生物学
• 关键词: RNAi Fank1 293T细胞
• 年，卷（期）: 2008,（6）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 350-355
• 页数: 6页
• 分类号: Q95-33
• 字数: 3798字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-5817.2008.06.002

摘要

目的 构建并筛选小鼠睾丸组织特异基因Fankl干扰载体,为进一步研究Fankl基因功能及与Fankl基因相关男性不育的基因治疗奠定基础.方法 根据Fankl基因cDNA序列,利用http://www.dharmacon.com/.在线设计软件设计2条干扰序列,分别克隆至带有H1启动子的质粒载体pSuper-neo-GFP中,同时从成年B6小鼠睾丸组织扩增Fank1基因全序列,构建Fank1基因与红色荧光蛋白表达融合载体pdsRED-Fank1.采用脂质体法将2个Fank1基因干扰载体及阴性对照分别与Fank1基因表达载体共转染293T细胞,并观察siRNA对Fank1基因的抑制效应及红色荧光蛋白表达情况,分别采用RT-PCR和Westernblot方法检测mRNA及蛋白质表达水平.结果 经PCR检测鉴定,舍干扰序列的重组质pSuper-shFankl 631#,pSuper-shFankl 247#及pdsRED-Fank1表达载体构建成功,测序分析完全正确.转染293T细胞36h后,荧光显微镜检查发现shFank1631、247均能明显抑制红色荧光蛋白表达,抑制效率分别为95%和90%,RT-PCR和Western blot 结果表明Fank1基因在mRNA和蛋白质水平都受到显著抑制(P＜0.05).结论 成功构建出小鼠睾丸特异基因干扰载体,为制备Fank1基因敲减转基因小鼠及研究Fank1基因在精子生成过程中的作用奠定了基础.