人KLK1和EGFP双顺反子重组腺病毒构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

• 作者: 余惠珍 朱鹏立 李体远 王华军 许昌声 谢良地
• 来源期刊: 中国病理生理杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 基因,人组织激肽释放酶 重组腺病毒载体 血管平滑肌细胞 绿色荧光蛋白
• 年，卷（期）: 2008,（2）
• 所属期刊栏目: 实验技术
• 页码范围: 411-416
• 页数: 6页
• 分类号: R363
• 字数: 5464字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1000-4718.2008.02.047

摘要

目的:构建携EGFP为报告基因和人组织激肽释放酶1(hKLK1)基因双顺反子的重组腺病毒(Ad-hKLK1-IRES-EGFP),并观察在自发性高血压大鼠(SHR)血管平滑肌细胞(VSMCs)中的表达变化.方法:通过双酶切质粒pBluesctitⅡKS-hKLK1,将hKLK1基因定向克隆至带有IRES-EGFP的腺病毒穿梭质粒pDC316中,构建成重组穿梭质粒,将其与腺病毒骨架质粒pBHGloxE1,3Cre共转染293A细胞,经包装并获得重组腺病毒,用PCR、酶切及测序方法对其进行鉴定,测定病毒滴度;用重组腺病毒感染VSMCs,用荧光显微镜下观察到的绿色荧光来测定感染率,用RT-PCR和Western blotting法测定hKLK1基因在VSMCs中的表达.结果:PCR、酶切和测序表明携EGFP的重组穿梭质粒pDC316-hKLK1-IRES-EGFP构建正确,并与骨架质粒在293A细胞中成功包装出重组腺病毒Ad-hKLK1-IRES-EGFP,其滴度为4.5×1011/L.重组腺病毒感染VSMCs后,在荧光显微镜下观察到明亮绿色荧光蛋白表达,感染率高达90%以上,可检测到hKLK1基因的mRNA及蛋白表达,并与感染时间(1 d-7 d)有显著依赖关系,峰值感染复数为100 MOI.结论:成功构建并包装了携EGFP和hKLK1基因的双顺反子重组腺病毒载体系统Ad-hKLK1-IRES-EGFP;感染VSMCs可检测到基因hKLK1和EGFP的独立共同高表达,该系统为一直观、安全、高效的基因转移系统.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	朱鹏立	福建医科大学省立临床医学院二内科	25	119	5.0	10.0
2	余惠珍		16	36	4.0	5.0
4	李体远		24	83	6.0	8.0
5	谢良地		8	92	6.0	8.0
6	许昌声		7	87	6.0	7.0
7	王华军		6	80	5.0	6.0