携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒的构建及其在人血管平滑肌细胞中的表达

• 作者: 唐俊明 孔霞 张蕾 杨建业 王家宁 郑飞 郭凌郧 黄永章
• 来源期刊: 郧阳医学院学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 报告基因 绿色荧光蛋白 细菌内同源重组 人血管平滑肌细胞 RNA干扰
• 年，卷（期）: 2009,（3）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 214-217,封2
• 页数: 5页
• 分类号: Q784
• 字数: 4146字
• 语种: 中文

摘要

目的:构建携带绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)基因的重组腺病毒质粒pAd-GFP,制备重组腺病毒Ad-GFP,并使GFP在血管平滑肌细胞中得到高效表达.方法:将线性化的穿梭质粒pRNAT-H1.1与腺病毒骨架质粒pAdeagy-1在感受态BJ5183内进行同源重组,并筛选出阳性重组子pAd-GFP;用Pac I酶切线性化pAdGFP,线性化的腺病毒质粒经脂质体转染AD293细胞,进行重组腺病毒的包装和扩增.采用CsCl密度梯度离心进行病毒浓缩和纯化.获得的腺病毒感染人血管平滑肌细胞(human vascular smooth muscle cell,hVSMC),观察其感染效率和GFP表达水平.结果:通过Pac I酶切证实腺病毒载体构建成功,包装出携带GFP基因的腺病毒,滴度达到4.5 × 1012pfu/mL,获得的腺病毒对hVSMC的感染效率约为100%.结论:利用细菌内同源重组方法成功地构建了携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒,并能够在hVSMC细胞中高效地表达,为利用GFP作为报告基因的研究奠定了实验基础.