甲胎蛋白特异性小干扰RNA重组腺病毒载体的构建

• 作者: 孙善会 张玉玲 汪运山 肖东杰 苏占涛 郏雁飞
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 甲胎蛋白类 RNA干扰 腺病毒科 重组,遗传
• 年，卷（期）: 2008,（37）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 7314-7317
• 页数: 4页
• 分类号: R318
• 字数: 4462字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2008.37.022

摘要

背景:RNA干扰技术的应用,关键在于能够采用1个有效的基因转移系统将小干扰RNA转入至靶细胞,目前广泛应用的是构建小干扰RNA表达载体.目的:利用AdMax腺病毒载体系统构建表达人甲胎蛋白-小干扰RNA的腺病毒载体.设计、时间及地点:开放性实验,于2007-03/10在山东大学附属济南市中心医院中心实验室完成.材料:穿梭质粒pDC316-EGFP-U6为本元正阳基因技术公司产品;AdMax KitD试剂盒与低代数HEK293细胞为Microbix Biosystems Inc.(Canada)公司产品.方法:选择针对甲胎蛋白 mRNA的特异性小干扰RNA靶序列,设计合成为相应的双链DNA,并将其与酶切线性化的pDC316-EGFP-U6载体片段连接,构建好的穿梭质粒pDC316-EGFP-U6-AFP-siRNA和腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组产生重组腺病毒.主要观察指标:对重组腺病毒进行聚合酶链反应鉴定及扩增、纯化、滴度测定.结果:构建的穿梭质粒载体经聚合酶链反应鉴定和测序分析,证实与设计一致.重组腺病毒Ad-AFP-siRNA经聚合酶链反应和绿色荧光蛋白表达检测证实构建成功,测定滴度为1.4×109 nfu/L.结论:实验成功构建了Ad-EGFP-U6-AFP-siRNA重组腺病毒.