慢病毒介导基于microRNA系统的HBs RNAi技术抑制HBV复制

• 作者: 吴孟超 姜小清 张柏和 徐峰 王红阳 程庆保 罗祥基 谭蔚锋
• 来源期刊: 第二军医大学学报
• 学科: 医学
• 关键词: RNA干扰 乙型肝炎表面抗原 慢病毒 乙型肝炎病毒
• 年，卷（期）: 2009,（3）
• 所属期刊栏目: 研究快报
• 页码范围: 295-299
• 页数: 5页
• 分类号: R373.21
• 语种: 中文
• DOI: 10.3724/SP.J.1008.2009.00295

摘要

目的:构建HBs基因RNAi慢病毒载体,观察其对HBV复制和抗原表达的作用.方法:针对已经筛选确定的HBs基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluⅠ和ClaⅠ酶切后的pGCLM-GFP载体连接产生慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用pGCLM-GFP、pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染包装细胞293T,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.培养HepG2.2.15细胞系,用慢病毒(MOI=1和MOI=10)对肝癌细胞进行感染,感染后细胞培养上清进行ELISA、Western印迹、HBV DNA定量分析.结果:PCR和测序结果证实,成功构建HBs shRNA的慢病毒载体.包装慢病毒后浓缩病毒悬液的滴度为5×108～2×109 TU /ml.慢病毒HBs RNAi后,对HBV复制和抗原表达的抑制作用显著.感染4 d后,抑制效应开始出现,一直持续到第9天,抑制效应达到高峰(P<0.05).相对于阴性对照,HBs shRNA作用后细胞上清中HBsAg分泌量下降70%以上(P<0.05),而Western印迹和real-time PCR结果进一步证实了上述结果,在蛋白水平和mRNA水平都得到了进一步验证.经HBV DNA定量,发现慢病毒RNAi后DNA水平也显著下降(P<0.05).结论:成功构建HBs基因RNAi慢病毒载体,以HBs基因为靶点的慢病毒介导的基于microRNA系统的RNAi技术能有效抑制HBV的复制和抗原表达.