猪源口蹄疫病毒China99/S株基因组全长cDNA的构建及其感染性鉴定

• 作者: 刘湘涛 尚佑军 常艳燕 王光祥 郑海学 靳野
• 来源期刊: 畜牧兽医学报
• 学科: 农学
• 关键词: 口蹄疫病毒 全长cDNA克隆 Poly(C) 反向遗传学
• 年，卷（期）: 2009,（2）
• 所属期刊栏目: 预防兽医
• 页码范围: 213-220
• 页数: 8页
• 分类号: S852.659|Q78
• 字数: 5197字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:0366-6964.2009.02.012

摘要

提取猪源FMDV China99/S组织样品总RNA,利用设计的引物对,分段进行扩增,获得覆盖全基因组的4个重叠片段(A、B、C和E),然后用BsmB Ⅰ/Xma Ⅰ、Xma Ⅰ/BamH Ⅰ、BamH Ⅰ/Not Ⅰ、Hpa Ⅰ/Kpn Ⅰ分别双酶切A、B、E、C,并纯化回收,依次定向克隆到带有聚合酶Ⅰ的pPⅠ cDNA3.1(+)转录载体内,最终得到重组质粒pP1-FMDVcDNA3.1(+);然后对该质粒进行序列测定.结果表明,China99/S株基因组全基因组序列长8 116 nt(含Poly(C)和Poly(A)片段),其中5′NCR长1 064 nt,蛋白编码区核苷酸序列为6 318 nt,编码1个由2 106个氨基酸组成的聚合蛋白,3′NCR长93 nt,其后是含有38个A碱基的Poly(A)尾.其中5′NCR引入含41个C的Poly(C)片段.将pPⅠ FMDVcDNA3.1(+)用脂质体转染法导入BHK-21细胞,传代培养,可以观察到典型的FMDV致细胞病变效应.利用CPE、电镜、动物试验、RT-PCR和序列测定进行检测,结果表明,从该系统中成功拯救出具有感染性的猪源FMDV China99/S株重组病毒.