以黑色素浓集荷尔蒙受体为靶点高通量筛选细胞模型的建立

• 作者: 张娅玲 成伟家
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: MCHR1 MCHR2 钙流检测 高通量筛选
• 年，卷（期）: 2009,（2）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 252-257
• 页数: 6页
• 分类号: R965.1
• 字数: 5509字
• 语种: 中文

摘要

背景:研究表明,激活黑色素浓集荷尔蒙(melanin concentrating hormone,MCH)受体可引起细胞内钙浓度的变化,通过检测钙浓度的变化可以反映受体的功能.目的:建立以MCHR为靶点的高通量筛选细胞模型.设计、时间及地点:对比观察,于2006-09/11在中国科学院北京基因组研究所药理组实验室完成.材料:人胎脑Total RNA购自STRATAGENE公司,经中国科学院北京基因组研究所药理组反转录为cDNA文库;人胚肾细胞系HEK293由中国医学科学院基础所细胞中心提供.方法:首先从人胎脑cDNA文库中得到MCHRl和MCHR2的全长cDNA,并将其克隆到pcDNA3.1载体中,构建人MCHR1,MCHR2基因的表达质粒,继而转染人胚肾293,通过G418筛选建立了稳定的表达人MCHR1和MCHR2的细胞株;进一步通过人MCHR的内源激动剂MCH及人MCHR1的特异性激动剂HD-01和拮抗剂ATC0175来检测细胞株的功能和稳定性.主要观察指标:通过对钙离了敏感的荧光指示剂Fluo-3,检测细胞内部反映钙离子浓度变化的荧光值,通过荧光值计算出反映受体活性的半数有效浓度EC50和半数抑制浓度IC50值,以及反映系统可靠性的Z因子.结果:实验建立了稳定表达MCHR1,MCHR2的高通量药物筛选细胞模型,对所建立细胞模型的功能、稳定性、特异性、高通量等特点进行检测.MCHR1细胞模型对MCH的Ecso值为173.72 nmol/L,对起特异性激动剂HD-01和拮抗剂ATC0175的EC50和IC50分别为37.42 nmol/L和13.6 nmol/L.而MCHR2细胞模型对MCH的EC50值为3 nmol/L,对HD-01和ATC0175则没有反应,MCHR1和MCHR2细胞模型的第1代和25代对激动剂和拮抗剂的反应是基本一样的.MCHR1和MCHR2细胞模型的Z因子为0.61和0.73,并对筛选条件进行了优化,确定_了实验系统中细胞的数量为3×104个/孔和二甲基亚砜的终浓度为不超过10 g/L系统最佳.结论:采用钙流测定方法可成功建立稳定的MCHR1和MCHR2筛选细胞株及可靠的筛选方法,该细胞模型可同时用于人MCHR激动剂与拮抗剂的筛选.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	张娅玲	中国科学院北京基因组研究所	2	7	1.0	2.0
5	成伟家	中国科学院北京基因组研究所	1	0	0.0	0.0