酵母双杂交系统筛选GATA-1相互作用蛋白质及功能验证

• 作者: 冯志伟 原艳芝 唐刘君 张卜兮 李长燕 杨晓明 王建 詹轶群 金超智 陈慧
• 来源期刊: 医学分子生物学杂志
• 学科: 生物学
• 关键词: GATA-1 酵母双杂交 蛋白质相互作用 免疫共沉淀 荧光素酶试验
• 年，卷（期）: 2010,（3）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 189-194
• 分类号: Q71
• 字数: 4176字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3870/j.issn.1672-8009.2010.03.001

摘要

目的 利用酵母双杂交技术从人脑cDNA文库中筛选与人GATA-1相互作用的蛋白质.方法 从人K562细胞中扩增出全长GATA1基因,设计引物将其3段截断体亚克隆入酵母表达载体pDBLeu中,转化至AH109感受态酵母中,利用酵母双杂交技术筛选人脑cDNA文库中与其相互作用的蛋白质,阳性克隆通过回转及免疫共沉淀试验进行验证,利用3xGATA荧光素酶报告基因对相互作用蛋白质进行功能验证.结果 成功构建出酵母诱饵蛋白表达质粒pDBLeu-GATA1(1),pDBLeu-GATA1(2),pDBLeu-GATA1(3),筛到34个阳性克隆,用生物信息学分析及回转验证得到5个与GATA-1相互作用的候选蛋白,通过免疫共沉淀试验进一步验证,获得3个蛋白质能与GATA-1相互作用,分别是ECSIT,EFEMP1和GPS2.荧光素酶试验表明这3个蛋白质均能对GATA1的转录活性产生影响,证实它们之间的相互作用具有影响GATA1转录的功能.结论 应用酵母双杂交技术及免疫共沉淀试验,从人脑cDNA文库中成功获得3个与GATA-1相互作用并对其转录活性具有调节作用的蛋白质,为研究GATA1蛋白质的功能提供了新的线索.