猪Ⅷ因子A1和A3结构域对翻译后剪接的人/猪杂合Ⅷ因子的促分泌作用

• 作者: 刘泽隆 屈慧鸽 朱甫祥 迟晓艳
• 来源期刊: 生理学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 人/猪杂合Ⅷ因子 分泌 内含肽 蛋白质反式剪接
• 年，卷（期）: 2010,（4）
• 页码范围: 373-381
• 页数: 9页
• 分类号: Q5|Q78
• 语种: 中文

摘要

凝血Ⅷ因子(fⅧ)蛋白的低效分泌以及基因过大是基于转fⅧ基因的甲犁血友病基因治疗的不利因素.本室前期用内含肽(intein)的蛋白质反式剪接实验证明,运用双载体共转fⅧ基因,通过翻译后蛋白质剪接,轻链可顺式促进fⅧ蛋白的分泌.本文用猪fⅧ蛋白的A1和A3结构域替换人fⅧ蛋白相应的结构,构建人/猪杂合fⅧ(human/porcine hybrid fⅧ,HP-fⅧ),研究基于内含肽的双载体转HP-fⅧ基因后剪接HP-fⅧ的分泌和活性.构建一对分别融合Ssp DnaB内含肽的HP-fⅧ重链和轻链基因表达质粒,瞬时共转染COS-7细胞,用ELISA和Coatest法定量分析分泌至培养上清中HP-fⅧ的剪接和生物活性,用Western blotting检测了细胞内HP-fⅧ的剪接.结果显示,双载体转HP-fⅧ基因细胞上清的剪接HP-fⅧ蛋白量为(184±34)ng/mL,活性为(1.18±0.22)IU/mL,明显高于双载体转人fⅧ基因[蛋白量为(48±12)ng/mL,活性为(0.31±0.10)IU/mL],提示猪fⅧ的A1和A3结构域能显著促进内含肽剪接的HP-fⅧ的分泌和活性;另外,还在混合培养的分别转内含肽融合HP-fⅧ重链和轻链基因细胞上清中检测到剪接的HP-fⅧ蛋白量为(27±5)ng/mL,活性为(0.19±0.07)IU/mL,提示内含肽对HP-fⅧ的剪接可不依赖细胞机制,分泌出胞的前体蛋白仍可进行剪接反应;双载体转HP-fⅧ基因细胞内检测到与转hfⅧ基因阳性对照细胞内hfⅧ条带大小接近的剪接HP-fⅧ蛋白条带,进一步证实HP-fⅧ的剪接.该结果为进一步在动物体内应用内含肽的双腺相关病毒载体转HP-fⅧ基因奠定了实验基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	屈慧鸽		72	330	10.0	15.0
2	刘泽隆		49	99	7.0	9.0
3	朱甫祥		38	21	3.0	4.0
4	迟晓艳		47	54	4.0	6.0