添加有扩增内标的副溶血弧菌PCR检测方法

• 作者: 何晓华 余水静 史贤明 孟江洪 施春雷 陈万义
• 来源期刊: 微生物学报
• 学科: 工学
• 关键词: 副溶血弧菌 PCR检测 扩增内标 假阴性
• 年，卷（期）: 2010,（3）
• 所属期刊栏目: 方法
• 页码范围: 387-394
• 页数: 8页
• 分类号: TS207.7
• 语种: 中文

摘要

[目的]发掘副溶血弧菌特异性更强的检测靶点,并人工构建扩增内标,建立可以有效避免假阴性的新PCR检测体系.[方法]利用生物信息学方法,从副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)基因组DNA中发掘特异性很高的序列,并设计相应的特异性引物,人工构建扩增内标,建立PCR检测体系.[结果]本研究发掘得到的序列vp1332特异性很强,经检索,该序列是编码ABC转运子接合蛋白组分的基因片段,根据此序列设计一对特异检测引物(vp1332L/vp1332R),同时,构建了扩增内标,并建立了PCR检测体系.利用该体系对296株副溶血弧菌和33株非副溶血弧菌进行检测,结果显示,所有以副溶血弧菌为模板的PCR反应均可扩增到一条343 bp的特异片段,而模板来源于非副溶血弧菌的则只能扩增到一条499 bp的扩增内标片段.灵敏度实验表明,该PCR反应体系的检测灵敏度为1.6×10~2cfu/mL.人工污染实验表明,起始染菌量为1.24 cfu/25 g样品时经8 h增菌,即可检测到副溶血弧菌.实际样品检测结果也证实该方法的有效性.[结论]本研究建立的PCR反应体系能特异地检测副溶血弧菌,并可有效地排除假阴性,提高检测准确率.