牛Klf4基因重组反转录病毒载体的构建及产毒细胞株的建立

• 作者: 吕长荣 窦忠英 辛晓玲 陈冬梅
• 来源期刊: 畜牧兽医学报
• 学科: 农学
• 关键词: 牛 Klf4基因 iPS细胞 反转录病毒载体
• 年，卷（期）: 2010,（12）
• 所属期刊栏目: 研究简报
• 页码范围: 1636-1641
• 分类号: S813.3|Q789
• 字数: 4149字
• 语种: 中文

摘要

为了克隆牛Klf4基因并构建重组反转录病毒载体,得到稳定的产毒细胞株,本研究设计了带有酶切位点的一对引物,以接触抑制生长状态的MDBK细胞为材料,用RT-PCR方法克隆出牛Klf4基因的开放阅读框序列,将之插入干细胞反转录病毒载体pMSCVneo构成真核表达载体pMSCV-Klf4;采用脂质体法将pMSCV-Klf4转染包装细胞PT67,通过G418筛选得到稳定的产毒细胞株,电镜观察培养液上清中的病毒颗粒,同时病毒感染NIH3T3细胞测定其病毒滴度.结果表明,本研究克隆的牛Klf4基因开放阅读框序列与已发表序列(NM-001105385)比对有99.9%的高同源性;构建的重组载体质粒可正常包装,电镜下可观察到典型的病毒颗粒,筛选出的产毒细胞株病毒滴度达7.16×107 CFU·mL-1.本研究成功构建的真核表达载体pMSCV-Klf4和得到的产毒细胞株,为进一步开展有关牛iPS细胞的研究奠定了基础.