鸡毒支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立

• 作者: 周云雷 张小华 李健 蒋红霞 魏飞龙
• 来源期刊: 中国农业科学
• 学科: 农学
• 关键词: 种特异性 pvpA 鸡毒支原体 实时荧光PCR SYBR GreenⅠ
• 年，卷（期）: 2011,（11）
• 所属期刊栏目: 兽医
• 页码范围: 2371-2378
• 分类号: S858.23
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2011.11.021

摘要

[目的]建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法.[方法]根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物.以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将其连接到PMD19-T载体,转化至大肠杆菌DH5 α中,经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90.以rPvpA90为模板建立SYBR Green Ⅰ荧光定量的标准曲线和溶点曲线,并进行特异性,灵敏性,重复性及临床样本检测试验,评价该方法的可行性.[结果]所建立的荧光定量PCR标准曲线循环闽值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系数为0.990.最低检测限为72拷贝/20μL,其敏感性比常规PCR至少高100倍;无论是对不同病原DNA单模板还是几种病原DNA混合模板进行扩增,该方法都呈现很好的特异性;重复性试验中,批内和批间变异系数均小于2%,表明该方法重现性好;临床样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法的检测率明显高于常规PCR方法.[结论]本研究初步建立了基于种特异性基因pvpA的鸡毒支原体荧光定量PCR方法,为养禽场诊断和监测鸡毒支原体病原提供一种新的特异、灵敏的方法.