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摘要:
目的 应用酵母双杂交技术筛选人胎脑cDNA文库中与人巨细胞病毒(HCMV)UL/b′ UL133编码蛋白相互作用的蛋白,为研究UL/b′编码蛋白的生物学功能,揭示HCMV先天感染的致病机制奠定基础.方法 设计特异性引物,在引物上下游分别引入NdeⅠ和BamHⅠ限制性内切酶识别位点,采用PCR技术扩增 HCMV临床分离株H株的UL133基因片段,将其扩增产物与载体pGBKT7 同时使用NdeⅠ和BamHⅠ进行双酶切,纯化后,将UL133片段插入到pGBKT7载体上,构建诱饵质粒 pGBKT7-UL133,并测序分析.利用醋酸锂小量酵母转化方法,将测序正确的诱饵质粒pGBKT7-UL133转化入AH109酵母感受态细胞中,然后将转化的菌液涂布在色氨酸缺陷型培养基(-Trp)上,筛选阳性菌落.再将人胎脑cDNA文库质粒转化到含pGBKT7-UL133质粒的AH109菌株中,在四缺培养基(-Ade/-His/-Leu/-Trp)中筛选,在铺有X-Gal的滤纸上进行显色反应,提取显蓝色的阳性酵母筛选质粒,运用电穿孔方法将其转化到TG1的大肠杆菌中,并行PCR鉴定,提取大肠杆菌中的文库质粒,并将其回转到含诱饵质粒pGBKT7-UL133 的酵母菌株中,进行回转验证.对筛选到的阳性克隆进行测序和生物信息学分析.结果 用于酵母双杂交筛选的诱饵质粒pGBKT7-UL133成功构建,含有诱饵质粒的酵母菌株在-Trp上生长.转化有人胎脑cDNA文库和诱饵质粒pGBKT7-UL133的酵母菌AH109,在四缺培养基中观察到有28个酵母菌落生长,通过显色反应、酵母质粒转化及回转酵母细胞筛选得到4个阳性克隆.通过序列比对,发现在这些基因中,其中一个基因编码人类还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)依赖性氧化还原酶1.结论 成功应用酵母双杂交系统筛选出与HCMV UL/b′区UL133编码蛋白相互作用的蛋白-NADPH,提示UL133蛋白可能在增加病毒毒力和传染性,干扰细胞间的信号传导和细胞的生长、分裂、凋亡等方面发挥重要作用.
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文献信息
篇名 筛选与分析与人巨细胞病毒UL133编码蛋白相互作用的蛋白
来源期刊 实用儿科临床杂志 学科 医学
关键词 人巨细胞病毒 UL133蛋白 酵母双杂交系统 人胎脑cDNA文库
年,卷(期) 2011,(10) 所属期刊栏目 感染性疾病
研究方向 页码范围 736-738
页数 分类号 R729
字数 3503字 语种 中文
DOI 10.3969/j.issn.1003-515X.2011.10.005
五维指标
作者信息
序号 姓名 单位 发文数 被引次数 H指数 G指数
1 马艳萍 中国医科大学附属盛京医院病毒研究室 25 29 3.0 4.0
2 阮强 中国医科大学附属盛京医院病毒研究室 48 227 7.0 14.0
3 齐莹 中国医科大学附属盛京医院病毒研究室 32 45 4.0 6.0
4 孙峥嵘 中国医科大学附属盛京医院病毒研究室 21 51 4.0 6.0
5 崔鑫 中国医科大学附属盛京医院病毒研究室 8 20 3.0 4.0
6 任高伟 中国医科大学附属盛京医院病毒研究室 5 7 2.0 2.0
7 王桂丽 中国医科大学附属盛京医院病毒研究室 3 9 2.0 3.0
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研究主题发展历程
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人巨细胞病毒
UL133蛋白
酵母双杂交系统
人胎脑cDNA文库
研究起点
研究来源
研究分支
研究去脉
引文网络交叉学科
相关学者/机构
期刊影响力
中华实用儿科临床杂志
半月刊
2095-428X
10-1070/R
大16开
河南省新乡市金穗大道601号新乡医学院《中华实用儿科临床杂志》编辑部
36-102
1986
chi
出版文献量(篇)
11163
总下载数(次)
39
总被引数(次)
100085
相关基金
国家自然科学基金
英文译名:the National Natural Science Foundation of China
官方网址:http://www.nsfc.gov.cn/
项目类型:青年科学基金项目(面上项目)
学科类型:数理科学
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