结核分枝杆菌输出重复蛋白(Erp)8基序突变体的构建及表达分析

• 作者: 孙毅 张斯民 李勇 李敏 王晶 赵东 郝秀静 马佳丽
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 结核分枝杆菌 输出重复蛋白(Erp) 重叠延伸PCR 原核表达
• 年，卷（期）: 2012,（9）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 1072-1079
• 分类号: S852.61
• 字数: 5320字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2012.09.012

摘要

结核病(TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的古老疾病,与艾滋病、疟疾一并成为当今世界威胁人类健康的三大传染病.输出重复蛋白(Erp)是结核分枝杆菌的一种重要毒力因子,在临床上具有一定的潜在应用价值.为了深入研究Erp的功能,本研究采用固相亚磷酰胺三酯化学方法合成包含8个PGLTS基序的基因Dom8,并利用重叠延伸PCR的方法将该片段与DomC (长度为520～855 bp)连接,经基因组装得到Erp蛋白8基序突变片段.进一步对获得的8基序全长基因进行C端、N端及CN两端缺失突变体,将其构建至原核表达载体pET-28a(+)上,将经酶切、PCR、测序鉴定的阳性质粒转化入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)pLysS菌株中.利用Tricine/SDS-PAGE、Western blot检测结核分枝杆菌Erp重组蛋白的表达情况.结果显示,通过重叠延伸PCR法成功扩增了erp基因PGLTS 8基序全长及8基序C-端、N-端和CN-端缺失突变体并构建至原核表达载体,经IPTG诱导后,用Tricine/SDS-PAGE得到大小分别约为13.0、17.1和6.7kD的目的蛋白.制备弗氏佐剂疫苗免疫试验兔,ELISA测定抗体效价,血清效价达到1∶512倍时,即可心脏采血分离,制备抗血清,并对提取的蛋白进行Western blot检测,结果表明,一抗为1∶200倍稀释的兔阳性血清,二抗为1∶800倍稀释的HRP标记的羊抗兔IgG-HRP；Western blot检测Erp MutC8、MutN8和MutCN8,结果显示,仅目的蛋白Erp MutC8和MutN8能被结核分枝杆菌Erp抗血清识别,表明,BL21 (DE3)pLysS (pET28a-C8)和BL21 (DE3)pLysS(pET28a-N8)所表达目的蛋白表达特异,可以被结核分枝杆菌Erp抗血清识别,具有良好的抗原性.研究结果为深入研究Erp的功能,制备结核病的诊断抗原和基因工程重组疫苗提供基础资料.