一种果胶裂解酶基因(pel)表达体系构建及其表达产物的酶学性质

• 作者: 冯湘沅 刘正初 成莉凤 段盛文 程毅 郑科 郑霞
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 关键词: 麻类脱胶 果胶裂解酶 原核表达 酶学性质
• 年，卷（期）: 2013,（5）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 546-553
• 页数: 8页
• 字数: 5185字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2012.05.006

摘要

本研究拟从麻类脱胶高效菌株Dickeya sp.DCE-01克隆果胶裂解酶基因(pel),并构建表达载体进行原核表达,对表达产物进行纯化和酶学性质研究.根据麻类脱胶高效菌株Dickeya sp.DCE-01全基因组序列预测的果胶裂解酶基因(pel)设计引物,PCR扩增后将该基因连接到pEASY-E1载体上,导入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)进行表达.采用超滤和Sephadex G-100凝胶层析两步法纯化胞外果胶裂解酶,并研究其酶学性质.结果表明:pel基因(GenBank登录号:JX964998)序列全长1164 bp,编码387个氨基酸,预测其N末端前35 AA为信号肽,前体蛋白分子量为41.4 kD,成熟蛋白分子量为37.8 kD.BL21(DE3)/pEASY-E1-pel发酵液的酶活力达27.82 IU/mL.SDS-PAGE分析两步法的纯化收集液,Pel活性组分显示为38 kD的优势条带；经Gel Analyzer 2010软件分析,显示该Pel组分纯度达98.6％.该Pel最适反应温度为55℃,在≤60℃时稳定；最适反应pH为9.5,pH 9.0～10.0时稳定.与橘子果胶和多聚半乳糖醛酸钠相比,苹果果胶为该Pel的最适底物.该果胶裂解酶的催化作用依赖于Ca2+,1.5 mmol/L的Ca2+能最大幅度提高酶活力；Mn2+、Pb2+和EDTA能严重抑制酶活力.从麻类脱胶高效菌株中克隆到果胶裂解酶基因,并在大肠杆菌成功表达；该酶的耐热耐碱性表明其在生物质加工过程中具有重要工业化应用前景.