高纯度诊断用重组甘油激酶的制备和鉴定

• 作者: 刘双凤 孟尧 孟延发 师慧 王帅坤 王振伟 郝杰清
• 来源期刊: 生物医学工程学杂志
• 学科: 生物学
• 关键词: 重组甘油激酶 乳糖 诱导表达 高密度发酵
• 年，卷（期）: 2013,（2）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 327-332,337
• 页数: 7页
• 分类号: Q55
• 语种: 中文
• DOI: 10.7507/1001-5515.20130062

摘要

用乳糖诱导重组甘油激酶(r-GK)在E.coli中高效表达,经300 L发酵罐发酵培养,建立了高效、低成本的r-GK发酵生产工艺.发酵菌体终密度OD600值达到42,r-GK表达量占菌体可溶性蛋白的30％左右.菌体破碎液经选择性热变性处理,Ni Sepharose FF层析二步纯化,产物纯度大于97％.经梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳(Gradient PAGE)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,r-GK分子量为120 kDa,由分子量相同的2个亚基组成.甘油激酶中2种NADH氧化酶和过氧化氢酶干扰酶未被检出.保存稳定性实验表明纯化后酶液在4℃条件下保存30d可保留约85％的活性,而冻干粉剂在4℃条件下保存1年活性仍可保留93％以上.