大鼠UT-B重组腺病毒载体的构建及体外转染Caco-2细胞后基因表达

• 作者: 刘怡晟 张征 潘曙明 蒋更如 陈凉
• 来源期刊: 湖南中医药大学学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 尿素转运蛋白B 腺病毒载体 Caco-2细胞 大鼠
• 年，卷（期）: 2013,（8）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 66-70
• 页数: 5页
• 分类号: Q78
• 字数: 5477字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-070X.2013.08.031.066.05

摘要

目的 采用Gateway TM技术构建含大鼠尿素转运蛋白B(Urea transporter B,UT-B)和增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的重组腺病毒载体,并以该载体体外转染Caco-2细胞,观察Caco-2细胞内UT-B的表达.方法分别以pMD18-UT-B和IRES2-EGFP质粒为模板,PCR扩增UT-B和IRES-EGFP序列,通过引物重叠区进行PCR拼接,并在UT-B-IRES-EGFP两端引入attB1、attB2重组臂序列.PCR产物经BP重组系统将UT-B-IRES-EGFP融合基因重组到入门载体pDONR221中,构建入门克隆.入门克隆与表达载体pAD/CMV/V5-DEST使用LR重组系统进行体外重组,构建表达克隆pAD-UT-B-IRES-EGFP,pAD-UT-B-IRES-EGFP转化DH-5α,筛选阳性克隆,PCR及测序验证.pAD-UT-BIRES-EGFP用Pac I酶切线性化后由Lipofectamine 2000介导转染293A细胞,包装病毒,收集病毒液并测定滴度.重组的腺病毒体外感染培养的Caco-2细胞,RT-PCR观察Caco-2细胞中UT-B mRNA的表达.结果成功构建了pAD-UT-B-IRES-EGFP载体,经PCR及测序验证,表达载体包含UT-B基因,且序列与GeneBank中收录的大鼠UT-B序列一致.重组的腺病毒感染Caco-2细胞后可检测到UT-B mRNA的表达.结论利用GatewayTM系统成功构建了包含UT-B和IRES-EGFP的腺病毒表达载体,为进一步研究其功能奠定了基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	张征	上海交通大学医学院附属新华医院肾脏内科	27	47	5.0	6.0
2	潘曙明	上海交通大学医学院附属新华医院肾脏内科	95	533	13.0	17.0
3	蒋更如	上海交通大学医学院附属新华医院肾脏内科	83	415	11.0	17.0
4	刘怡晟	上海交通大学医学院附属新华医院肾脏内科	14	76	5.0	8.0
5	陈凉	上海交通大学医学院附属新华医院肾脏内科	6	32	4.0	5.0