基于反转录实时荧光定量PCR的3种标准曲线定量活副溶血性弧菌的差值分析

• 作者: 孙文烁 孙晓红 李沁 潘迎捷 赵勇 靳梦瞳
• 来源期刊: 微生物学报
• 学科: 生物学
• 关键词: Real-time RT-PCR 标准曲线 副溶血性弧菌
• 年，卷（期）: 2014,（4）
• 所属期刊栏目: 遗传和分子生物学
• 页码范围: 383-390
• 分类号: Q933
• 语种: 中文
• DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.2014.04.004

摘要

[目的]比较分析基于反转录实时荧光定量PCR (Real-time Reverse-Transcriptase PCR,Real-time RT-PCR)技术建立的3种标准曲线定量样品中活副溶血性弧菌数量的差异性.[方法]体外转录合成带有目的片段(tlh基因)的RNA标准品,提取纯培养副溶血性弧菌(108 CFU/mL) RNA样品,提取接种于虾上副溶血性弧菌(106CFU/g) RNA样品,将3种RNA样品分别反转录得到cDNA,10倍梯度稀释,进行Real-time PCR扩增,建立标准曲线A、B、C(其中标准曲线A和C为本研究首次建立).用标准曲线A、B、C分别定量6个样品(2个纯培养副溶血性弧菌样品、2个人工污染煮熟南美白对虾样品和2个人工污染生南美白对虾样品)中活副溶血性弧菌数量,并与传统涂布计数法进行比较,分析定量结果的差异性.[结果]3种标准曲线均具有较好的线性关系(R2 ＞0.99);3种标准曲线定量6个样品中活副溶血性弧菌结果均显著(p＜0.05)低于涂布定量结果,与涂布定量结果的相对误差大小顺序为:标准曲线A(30.0％)＞标准曲线C(18.8％)＞标准曲线B(6.9％);标准曲线A对6个样品定量结果与标准曲线B、C定量结果的差值平均值分别为-2.25Lg CFU/mL和-0.75 Lg CFU/mL,相对误差平均值为48.2％和15.9％,标准曲线B与C对6个样品定量结果的差值在(1.47-1.53) Lg CFU/mL之间,相对误差在19.0％-23.8％之间.[结论]标准曲线B可以广泛应用于Real-time RT-PCR准确定量样品中微生物数量.