表达HIV-1 gag重组鸡痘病毒的构建与筛选

• 作者: 刘存霞 朱羿龙 李昌 杜寿文 王茂鹏 郭焱 金宁一
• 来源期刊: 中国生物工程杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 重组鸡痘病毒 HIV-1 gag 强型荧光蛋白 遗传稳定性
• 年，卷（期）: 2014,（1）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 57-63
• 分类号: R373.9
• 语种: 中文
• DOI: 10.13523/j.cb.20140109

摘要

构建并筛选表达HIV-1 gag蛋白的重组鸡痘病毒,并对其进行鉴定.首先设计引物通过PCR技术扩增HIV-1 gag基因,将其连接到pMD18-T载体上,测序正确后将其克隆入本实验室自行构建的鸡痘病毒穿梭载体pTKET中,获得重组质粒pTKET-HIV gag.然后将其与鸡痘病毒FPV282E4株共转染原代鸡胚成纤维细胞(CEF)进行同源重组,以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为筛选标记,通过噬斑筛选获得重组病毒,应用PCR,RT-PCR,Western blot方法对重组病毒进行鉴定和遗传稳定性分析.结果:通过10次噬斑筛选,PCR检测表明目的基因已整合到重组鸡痘病毒基因组中,RT-PCR,Western blot结果表明HIV-1 gag在感染细胞内成功表达且具有抗原性.连续传代20次,PCR,RT-PCR,Western blot均能检测到外源基因的整合、转录和表达,且未能扩增出FPV-TK基因,表明重组病毒遗传稳定性良好,而且病毒已经纯化.结论:成功获得表达HIV-1gag的重组鸡痘病毒,为进一步免疫试验研究奠定基础.