火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶基因克隆、表达纯化和酶学性质研究

• 作者: 何建华 刘亚辉 周欢 孙丽华 徐春艳 杨敏 郁峰 陈亚星
• 来源期刊: 微生物学通报
• 关键词: 火球菌 8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶 碱基切除修复
• 年，卷（期）: 2014,（1）
• 所属期刊栏目: 基因克隆及功能研究
• 页码范围: 67-74
• 语种: 中文
• DOI: 10.13344/j.microbiol.china.130043

摘要

[目的]在大肠杆菌中表达火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶,纯化得到重组火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶,在此基础上系统研究火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶的酶学特征.[方法]构建8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶重组表达质粒,将重组质粒转化Eseherichia coli Rosetta (DE3),利用IPTG诱导表达重组蛋白,通过Ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白;最后利用含8-氧鸟嘌呤损伤的寡核苷酸作为底物,测定8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶的酶学性质.[结果]在大肠杆菌中成功诱导表达了重组火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶,经Ni2+亲和纯化后蛋白纯度大于95％.在体外鉴定了重组火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶的酶学性质.结果表明重组火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶可以切除DNA中的8-氧鸟嘌呤(8-Oxo-G,GO)损伤碱基,并且具有AP裂解酶活性.重组火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶催化反应的最适pH值和温度分别是pH 8.5和55℃.除Zn2+对火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶的酶促反应有明显的抑制作用外,实验中测定的其它二价离子(Mn2+,Mg2+,Ca2+,Ni2+,Co2+,Cu2+)对其没有明显的影响.离子强度在50-100 mmol/L范围内对其酶促反应影响不大,超过100 mmol/L时有明显的抑制作用.与8-氧鸟嘌呤互补的碱基差异对火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶切除8-氧鸟嘌呤损伤的效率影响不大;但与单链DNA相比,双链DNA是优选底物,切割效率如下:GO/C≈GO/G≈GO/T≈GO/A＞GO/-.[结论]在大肠杆菌中成功表达,并Ni2+亲和纯化了火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶,生化研究表明制备的重组蛋白具有8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶活性,可能负责切除火球菌基因组DNA中的8-氧鸟嘌呤损伤.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	杨敏	中国科学院上海应用物理研究所	237	4741	38.0	57.0
2	何建华	中国科学院上海应用物理研究所	20	71	4.0	8.0
3	孙丽华	中国科学院上海应用物理研究所	13	267	6.0	13.0
4	徐春艳	中国科学院上海应用物理研究所	6	2	1.0	1.0
5	刘亚辉	中国科学院上海应用物理研究所	3	8	2.0	2.0
6	周欢	中国科学院上海应用物理研究所	2	0	0.0	0.0
7	陈亚星	中国科学院上海应用物理研究所	1	0	0.0	0.0
8	郁峰	中国科学院上海应用物理研究所	4	1	1.0	1.0