NSPc1-siRNA重组慢病毒的构建及其对U87细胞NSPc1基因的沉默效应

• 作者: 李辉 樊嵘 沈静 龚燕华
• 来源期刊: 武警后勤学院学报（医学版）
• 学科: 医学
• 关键词: NSPc1 siRNA 慢病毒载体 基因沉默 U87细胞
• 年，卷（期）: 2014,（12）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 981-984,封2
• 页数: 5页
• 分类号: R393
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.2095-3720.2014.12.001

摘要

[目的]构建包装NSPc1-siRNA慢病毒颗粒,并在 U87胶质瘤细胞中鉴定其感染及基因沉默效果.[方法]根据GenBank中基因信息,采用干扰序列设计软件设计靶点,制备合成GV118-siRNA目的质粒,转化感受态细胞,对于长出的克隆应用菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和对比分析,重组病毒质粒与另外2种辅助包装载体质粒通过LipofectamineTM2000共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,将病毒浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度;并检测病毒颗粒在目的细胞U87胶质瘤细胞中的感染效率,实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blotting方法检测NSPc1 siRNA慢病毒对U87中NSPc1的干扰作用.[结果]成功构建NSPc1 siRNA慢病毒载体GV118-siRNA,重组病毒滴度为4×108 TU/ml;用该病毒体外感染U87胶质瘤细胞,当感染复数(MOI)为10时,感染效率大于90％; RT-PCR和Western blotting方法检测NSPc1基因沉默的效率分别为66.4％、60.0％.[结论]成功构建了NSPc1 siRNA慢病毒载体GV118-siRNA,该重组病毒包装后在体外感染U87胶质瘤细胞的效率较高,且具有显著的基因沉默效果.