抗VEGF单克隆抗体Fab片段在E.coli中的分泌表达

• 作者: 刘峥兆 卢大儒 朱化星 王志龙 王英明
• 来源期刊: 中国生物工程杂志
• 学科: 生物学
• 关键词: 抗VEGF Fab抗体片段 大肠杆菌 分泌表达
• 年，卷（期）: 2014,（7）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 30-37
• 分类号: Q786
• 语种: 中文
• DOI: 10.13523/j.cb.20140705

摘要

目的:在大肠杆菌中构建、表达和纯化抗血管内皮生长因子(VEGF)的Fab片段(兰尼单抗,ranibizumab),通过发酵条件的控制实现其在大肠杆菌周质和胞外的高效分泌表达,并检测其抗VEGF的活性.方法:以pET30a为质粒载体,构建了Fd链和L链前都含有OmpA信号肽、SD序列和T7 promoter的克隆载体pET30a(+)-LC-HC,转化BL21(DE3)表达菌株,并进行了培养基、温度和IPTG诱导浓度的条件优化.结果:确定Fab片段在大肠杆菌分泌表达摇瓶发酵最佳条件为:在含有1.5％ Tryptone,1％ Yeast Extract,0.5％ Glucose,0.15％ NaCl,0.1％ NH4Cl,0.08％MgCl2·6H2O的1L培养基的摇瓶中,按照10％的接种量,37C摇床培养至对数生长后期(OD600为2左右),添加0.1 mmol/L IPTG诱导剂,于16℃条件下诱导表达过夜(16h左右).用周质破菌提取分泌至大肠杆菌周质腔的Fab片段,同时用中空纤维柱浓缩发酵培养基,最后用ProteinG亲和层析柱一步纯化洗脱,经SDS-PAGE检测分析和Brand ford法测蛋白浓度得出纯化的Fab抗体片段纯度在90％以上,分泌表达纯化量为0.4mg/L.以VEGF165作为结合抗原,间接ELISA分析纯化后的Fab抗体EC50=30ng/ml.继续用该培养基在3.7L体积发酵罐中进行2L体积的发酵,获得最终的菌体产率为30g/L,可亲和纯化Fab抗体量为1.94mg/L.结论:成功实现了Fab抗体片段在大肠杆菌中的高效分泌表达,且具有很高的活性,为规模化制备Fab抗体片段提供了研究依据.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	卢大儒	复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室	137	982	17.0	25.0
2	王志龙	复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室	1	4	1.0	1.0
3	王英明		1	4	1.0	1.0
4	刘峥兆		1	4	1.0	1.0
5	朱化星		2	8	2.0	2.0