茶树谷胱甘肽还原酶基因CsGRs的克隆与表达分析

• 作者: 周艳华 岳川 曹红利 杨亚军 王新超 王璐 郝心愿
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 茶树 谷胱甘肽还原酶(GR) 逆境胁迫 表达分析
• 年，卷（期）: 2014,（16）
• 所属期刊栏目: 园艺
• 页码范围: 3279-3291
• 页数: 13页
• 语种: 中文

摘要

【目的】克隆谷胱甘肽还原酶基因CsGRs，研究CsGRs在茶树抵御不同逆境胁迫中的作用。【方法】在茶树转录组数据库中搜索茶树CsGRs，根据获得的基因片段，设计反转录PCR（RT-PCR）引物和RACE-PCR特异引物，从茶树中克隆 CsGRs的 cDNA 全长序列，并利用在线生物信息学软件对其进行分析。采用实时荧光定量 PCR （qRT-PCR）分析CsGRs在茶树不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高盐胁迫和ABA处理下的表达模式，利用分光光度计测定低温胁迫和干旱胁迫下叶片中还原型谷胱甘肽（GSH）的含量变化。【结果】RT-PCR克隆获得CsGR1的cDNA全长，其长度为1827 bp，包含1482 bp开放阅读框（ORF），编码493个氨基酸；RACE扩增获得712 bp和1624 bp的5′和3′末端序列，拼接并进行RT-PCR验证后得到CsGR2序列，全长2282 bp，包含1698 bp ORF，编码565个氨基酸；CsGR1和CsGR2的GenBank登录号分别为KF906411和KF418080。CsGR1和CsGR2编码的蛋白质分子量分别为53.9 kD和61.0 kD，无信号肽位点，均为非分泌性蛋白。亚细胞定位预测CsGR1主要定位在细胞质等亚细胞中，无叶绿体锚定信号肽位点；CsGR2中N-端的71个氨基酸残基具有叶绿体转运信号功能，主要定位在叶绿体上。序列相似性比较显示，CsGR1与其他植物中胞质GR的相似性均在80％以上，而与叶绿体GR的相似性低于60％；CsGR2与其他叶绿体GR的相似性70％以上，与胞质GR的相似性在50％左右。二者在核酸序列和氨基酸序列水平上分别有63.4％和49.9％的相似性，且蛋白质二级结构也具有较高的相似性。系统发育树显示，CsGR1与胞质GR聚为一类，而CsGR2与叶绿体GR聚在一起，且都与葡萄的亲缘关系最近。二者均含有氧化还原二硫键活性位点、谷胱甘肽结合位点以及 NADPH结合的 Arg保守位点等结构域。CsGR1为胞质GR，CsGR2为双向定位在叶绿体和线粒体上的叶绿体GR。CsGR1在花和根中表达量较高，在叶片和茎中表达量低；CsGR2在叶片和茎中的表达量比在根和花中的表达量高。在短时胁迫处理24 h过程中，成熟叶片在100μmol·L-1 ABA处理后，CsGR1和CsGR2的表达均被抑制，且CsGR2的抑制作用较显著；在4℃低温胁迫下， CsGR1的表达被抑制，而CsGR2的表达随处理时间延长逐渐被诱导；250 mmol·L-1 NaCl盐胁迫抑制CsGRs的表达，但胁迫24 h时CsGR2的表达被诱导。10%（w/v）PEG胁迫处理茶树8 h，叶片中的CsGRs均被诱导表达，且在复水48 h后CsGR1的表达被显著上调；根中CsGRs的表达在处理和复水48 h过程中均被抑制。随低温胁迫时间延长，茶树叶片中的GSH含量逐渐升高；干旱胁迫也能促进GSH在叶片中的积累，在复水48 h后又恢复到处理前的水平。【结论】克隆了2个茶树CsGRs，2个基因对4℃低温、NaCl盐、10％PEG和ABA处理均具有响应。推测CsGRs在茶树抵御逆境胁迫中起作用。