乳铁蛋白抗菌-乳源免疫调节融合肽的表达纯化及其基因对SKOV3细胞的影响

• 作者: 张文晓
• 来源期刊: 安徽医科大学学报
• 关键词: 融合肽 表达 纯化 慢病毒载体 细胞凋亡
• 年，卷（期）: 2014,（10）
• 所属期刊栏目: 学位论文摘要
• 页码范围: 1375-1375
• 页数: 1页
• 字数: 794字
• 语种: 中文

摘要

目的构建并鉴定牛乳铁蛋白抗菌-乳源免疫调节融合肽(简称 LIFP)基因的重组载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达和纯化,获得较高纯度的融合肽；研究LIFP基因体外对卵巢癌细胞SKOV3的影响,为基因治疗卵巢癌提供基础。方法以GEN-BANK报道的牛乳铁蛋白抗菌肽( LFCINB )与乳源免疫调节肽( PGPIPN )的序列为参照,以连接臂GGGGS连接两种肽,合成融合肽LIFP基因,并在其5'端加入凝血酶FXA识别的酶切位点。将LIFP基因构建到表达载体 PGEX-KG 中, PCR 筛选阳性克隆,测序鉴定后,采用最优表达条件诱导重组载体在大肠杆菌BL21中表达,超声裂菌后, SDS-PAGE和Western-blot鉴定融合蛋白( LIFP-GST),通过AKTA层析系统纯化融合蛋白, FXA酶切后,高效液相色谱( HPLC)、质谱( MS)鉴定LIFP的表达；将LIFP基因构建到PLJM1载体[含CMV启动子和绿色荧光蛋白( GFP )中,获得 PLJM1-LIFP 慢病毒表达载体,经PCR检测及测序鉴定后,与慢病毒包装质粒通过 LIPOFEETAMINE 2000共转染至包装细胞293T,包装产生病毒液,并测定其滴度；体外培养人卵巢癌细胞SKOV3,重组慢病毒感染细胞后, MTT法观察融合肽对SKOV3细胞的生长抑制作用, HO-ECHST33258染色观察细胞核形态的变化。结果PCR和测序证实成功构建了PGEX-KG-LIFP重组载体；WESTERN-BLOT 结果显示成功诱导LIFP 的高表达；HPLC显示获得较高纯度LIFP；MS显示氨基酸序列与目的肽一致；成功构建PLJM1-LIFP慢病毒表达载体,三质粒共转染293 T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光。包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为1.2×108 TU/ml；重组病毒感染SKOV3细胞后, MTT 结果显示融合肽对体外培养的 SKOV3细胞生长具有抑制作用(P<0.05),荧光显微镜观察到凋亡细胞典型的形态学特征。结论成功诱导表达纯化融合肽,并初步证实对体外SKOV3有生长抑制和诱导细胞凋亡作用。

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	张文晓	安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室	4	23	3.0	4.0