苹果细菌人工染色体双色DNA纤维荧光原位杂交体系的建立及应用

• 作者: 渠慎春 王三红 章镇 蔡斌华
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 苹果 细菌人工染色体 DNA纤维荧光原位杂交
• 年，卷（期）: 2014,（11）
• 所属期刊栏目: 园艺
• 页码范围: 2205-2213
• 页数: 9页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.014

摘要

【目的】建立苹果DNA纤维荧光原位杂交（Fiber FISH）技术体系，从而为利用该技术确定苹果基因组DNA序列间的位置关系、构建精细物理图谱等方面的应用奠定基础。【方法】以‘Florina’苹果幼叶为试材，通过液氮研磨，尼龙膜过滤和TritonX-100去除叶绿素等步骤提取细胞核。细胞核经碱裂解，采用盖玻片拉伸方法制备DNA纤维。比较细胞核不同裂解时间和在5种不同包被类型的载玻片上DNA纤维拉伸的效果。用碱裂解方法提取来自苹果‘Florina’自交不亲和S9基因座的4个细菌人工染色体（Bacterium Artificial Chromosome） BAC 34G16、 BAC 45M19、BAC 70J19和BAC 69A4。提取的质粒经PEG纯化，用地高辛或生物素标记探针。探针与DNA纤维制片经过80℃变性、37℃杂交2-3 d和洗片，采用“三明治”方法进行信号放大和检测，在荧光显微镜下观察试验结果。【结果】建立了以苹果幼叶为材料，液氮研磨提取细胞核，碱裂解细胞核和盖玻片拉伸制备DNA纤维的试验方法。提取的细胞核纯净、结构完整，细胞核浓度＞5×103个/μL。试验结果表明，细胞核裂解4 min，在多聚赖氨酸包被的载玻片上制备的DNA纤维平直、伸展均匀，纤维量多、细长，效果好。经原位杂交和信号检测，获得了清晰的、具有Fiber FISH典型特征的“念珠状”杂交信号。对已知大小和位置关系的两个BAC克隆BAC 34G16和BAC 45M19进行杂交信号测量和分析，得出BAC 克隆大小（Y，Kb）与信号长度（X，μm）的相关方程为Y=3.47X（R2=0.9215），其斜率即为该试验技术体系Fiber FISH的分辨率3.47 kb·μm-1。试验对未知大小和位置关系的两个BAC克隆BAC 70J19和BAC 69A4成功地进行了鉴定，它们大小分别为(112.1±18.4)kb和(133.2±16.3)kb，之间有（90.2±7.3）kb的重叠区域。【结论】建立了以苹果幼叶提取细胞核，制备DNA纤维和原位杂交的方法，获得了高分辨率的苹果DNA纤维原位杂交试验技术体系。