禽呼肠孤病毒σ3基因在烟草中的表达与鉴定

• 作者: 刘加波 曾婷婷 王盛 罗思思 谢丽基 谢志勤 谢芝勋 邓显文 黄莉
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 禽呼肠孤 σ3基因 植物表达载体 烟草
• 年，卷（期）: 2015,（9）
• 所属期刊栏目: 畜牧?兽医?资源昆虫
• 页码范围: 1836-1844
• 页数: 9页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.17

摘要

【目的】研究禽呼肠孤病毒S1基因编码的σ3基因在烟草中的表达及其表达产物的反应原性。【方法】根据 GenBank 中公布的禽呼肠孤毒株 S1133的基因序列，设计特异引物扩增σ3基因，构建重组植物表达载体pBI121-σ3，热激法转化农杆菌EHA105感受态细胞，筛选含有重组质粒的pBI121-σ3的阳性工程菌株EHA105。采用农杆菌介导的叶盘法转化野生型烟草，卡那霉素筛选获得抗性植株。随后通过σ3基因的特异引物，PCR方法初步筛选获得转σ3基因的烟草植株。进一步对阳性植株通过实时荧光定量PCR方法检测σ3基因在转基因烟草中的拷贝数，以烟草自身单拷贝的内源基因核糖核酸还原酶-RNR2作为内参基因，通过梯度稀释分别构建 RNR2及σ3基因的起始模板量和对应 CT值的标准曲线，通过检测样品中σ3基因和RNR2基因模板量对数值的比值估算出σ3基因在转基因烟草中的拷贝数。并通过Western-blotting方法对转基因烟草中表达的σ3融合蛋白的反应原性进行分析。【结果】①通过双酶切和测序验证表明σ3基因插入位置、大小和读码框均正确，表明σ3基因已经成功的构建于植物表达载体pBI121的花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子的下游，以NOS为终止子，含有卡那霉素抗性标记（NPT II）。其表达的蛋白与下游的绿色荧光蛋白形成融合蛋白，其大小约为61.6 ku；②在转化筛选抗性植株的过程中采用350 mg·L-1的头孢霉素可以很好地抑制农杆菌的污染，100 mg·L-1的硫酸卡那霉素筛选压力能够很好地抑制非转化细胞的生长；③随机选取10株转化烟草进行PCR检测发现8株转化烟草可以扩增到清晰的目的条带约994 bp；④内参基因RNR2的标准曲线为y=-3.5352x+15.143，σ3基因的标准曲线为y=-3.5366x+1.8265，两个标准曲线的相关系数均接近于1。在检测的5株转化烟草中σ3基因的拷贝数均为4，阴性对照没有扩增。⑤Western-blotting显示σ3融合蛋白在转化烟草中可以正确表达，目的条带大小约为61.6 kD，与预计大小一致；σ3融合蛋白能够与禽呼肠孤病毒的阳性血清发生特异反应，表明该融合蛋白具有良好的反应原性。【结论】成功地构建了植物表达载体pBI121-σ3，筛选获得低拷贝的转σ3基因的烟草，σ3融合蛋白能够在烟草中表达且具有相应的反应原性，为进一步研究σ3基因的功能和利用植物作为生物反应器生产σ3蛋白口服疫苗的研发奠定了基础。