利用MigR1质粒构建CD19-CAR逆转录病毒载体优化其对人原代T细胞的转染效率

• 作者: 华亦斐 周虹 唐古生 徐丽丽 王扬 程辉 胡晓霞 阮婕 顾海慧
• 来源期刊: 中华血液学杂志
• 关键词: 受体,抗原 质粒,MigR1 转染 T淋巴细胞 细胞因子类
• 年，卷（期）: 2015,（4）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 331-336
• 页数: 6页
• 字数: 5314字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2015.04.016

摘要

目的 优化二代CD19嵌合抗原受体(CD19-CAR)逆转录病毒载体对人原代T细胞的转染效率.方法 应用重组DNA技术将CD 19-CAR构建入逆转录病毒载体,转入plat-A包装细胞收集病毒上清并转染人原代T细胞及K562细胞系,采用流式细胞术检测不同条件下的转染效率,用RT-PCR方法检测目的基因的表达情况,用ELISA法检测IFN-γ、TNF-α表达水平.结果 ①MigR1-CD 19-CAR逆转录病毒载体成功构建后包装高滴度逆转率病毒;②相同条件下,MigR1-CD 19-CAR逆转录病毒对K562细胞系转染效率显著高于T细胞;③对T细胞,离心120 min组的转染率为(54.5±14.6)％,明显高于未离心组、离心30 min组及离心60 min组(P值均＜0.05);④CD3/CD28磁珠与rhIL-2联合对人T细胞活化扩增效率个体差异显著,根据扩增倍数优化个体转染时机可提高转染效率(最高达69.3％),且RT-PCR检测证实CD 19-CAR目的基因在转染后72 hT细胞中高效特异性转录;⑤CD19-CAR-T细胞与CD19-K562细胞共培养组IFN-γ、TNF-α表达水平均增加,分别为(13 230±1 543)pg/ml、(4 217±211)pg/ml,与阴性对照组比较差异均有统计学意义(P值均＜0.01).结论 通过MigR1-CD 19-CAR逆转录病毒载体转染人原代T细胞,并通过延长离心转染时间、根据扩增倍数确定个体转染时机而成功优化转染效率,RT-PCR检测CD 19-CAR目的基因在转染后人T细胞中高效特异性转录,CD 19-CAR-T细胞特异性识别靶细胞引发IFN-γ、TNF-α表达水平增加.