狂犬病病毒磷蛋白重组人5型腺病毒的构建及鉴定

• 作者: 严妍 刘晔 张守峰 扈荣良 王东方 王述超 靳红亮 高菽蔓
• 来源期刊: 中国生物制品学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 狂犬病病毒 磷蛋白 人5型腺病毒
• 年，卷（期）: 2015,（10）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 1023-1027
• 分类号: R373.9|Q782
• 语种: 中文

摘要

目的 构建表达狂犬病病毒(rabies virus, RABV)BD06株磷蛋白(phosphoprotein,P)的重组人5型腺病毒,并进行鉴定.方法 质粒pMD 18-T-BD06P经双酶切后,获得完整的P蛋白基因,将其克隆至腺病毒表达系统穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA,构建重组穿梭质粒pacAd5CMV-BD06P,与骨架质粒pacAd5 9.2-100经Pac Ⅰ酶切线性化后,共转染HEK293AD细胞,经同源重组,获得表达RABV P蛋白的重组人5型腺病毒rAd5-BP.采用Kaber法计算rAd5-BP滴度,RT-PCR、Western blot、直接免疫荧光方法(direct immunofluorescence assay,dFA)检测P蛋白基因在HEK-293AD细胞的转录及表达水平.以107 TCID50 rAd5-BP肌肉注射免疫昆明小鼠,14 d后,经尾静脉采血,分离血清,IFA法检测抗RABVP蛋白抗体及其反应活性.结果 经酶切及测序鉴定证明重组穿梭质粒pacAd5CMV-P构建正确;重组腺病毒rAd5-BP滴度可达108 TCID50/ml,能够介导P蛋白在HEK293AD细胞中的转录及表达,接种小鼠后可刺激机体产生针对RABVP蛋白抗体,且与RABV具有良好的反应活性.结论 成功构建了RABVBD06株P蛋白重组人5型腺病毒,该病毒能够介导P蛋白在小鼠体内有效表达,刺激机体产生针对RABVP蛋白抗体,且与RABV具有良好的反应活性,为进一步研究RABV P蛋白在病毒感染过程中的作用奠定了基础.