草莓轻型黄边病毒RT-LAMP检测方法的建立

• 作者: 冉策 刘正坪 尚巧霞 赵晓燕 邢冬梅 陈柳 陈笑瑜 魏艳敏
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 草莓轻型黄边病毒 反转录等温扩增技术 检测
• 年，卷（期）: 2015,（3）
• 页码范围: 614-621
• 页数: 8页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.03.20

摘要

【目的】草莓轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus，SMYEV）是侵染草莓的重要病毒，严重影响草莓果实的产量和品质。研究旨在建立利用反转录等温扩增技术（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP）检测SMYEV的方法。【方法】根据SMYEV外壳蛋白基因3′端保守序列设计4个特异性引物 SMYEV-FIP （5′-CAGATCAGCGACAATTTGGACTCCTGAGGAACTTGCTGCT-3′）、SMYEV-BIP （5′-GCTTTGTC GGGGATCCTGGGAAGGCTAAGTCGAAGAGACC-3′）、SMYEV-F3（5′-TCAAGTTGGTGACCCTTTCC-3′）和SMYEV-B3（5′-CGAGGAAC CAATGTCGTAGC-3′）。对RT-LAMP 检测体系中的条件进行优化，设置反应温度为60、61、62、63、64、65℃，反应时间为30、45、60、75 min，分别设置引物SMYEV-FIP/BIP浓度为1.0、1.2、1.4、1.6、1.8μmol·L-1，引物SMYEV-F3/B3浓度0.1、0.15、0.2、0.25、0.3μmol·L-1，设置Mg2+浓度为2、4、6、8、10 mmol·L-1，dNTPs浓度为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mmol·L-1，betaine浓度为0、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4 mol·L-1，DTT浓度为2.0、2.4、2.8、3.2、3.6、4.0μmol·L-1等，并对以上不同反应条件进行检测，确定优化后的 RT-LAMP 检测体系。选用其他常见的草莓病毒以及健康草莓植株叶片中的RNA作为模板，对RT-LAMP体系的特异性进行测定；将SMYEV的RNA进行10倍梯度逐级稀释，分别获得RNA原液、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7不同稀释液作为模板，比较RT-LAMP 和RT-PCR的检测灵敏度。RT-LAMP反应产物可以进行电泳和紫外成像检测，阳性样品出现瀑布状条带，阴性样品无条带，或者在反应产物中加入SYBR green I核酸染料，直接观察检测，阳性样品为绿色，阴性样品为橙色。【结果】建立了一种特异性检测 SMYEV 的 RT-LAMP 方法，经过各反应条件优化后的检测体系为1.0μmol·L-1 SMYEV-FIP/BIP、0.1μmol·L-1SMYEV-F3/B3、4 mmol·L-1 Mg2+、1.6 mmol·L-1 dNTPs、0.4 mol·L-1 betaine、2.0μmol·L-1 DTT，60℃反应45 min。选用SMYEV、草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）、草莓斑驳病毒（Strawberry mottle virus，SMoV）和草莓皱缩病毒（Strawberry crinkle virus，SCV）的RNA以及健康草莓植株叶片中的RNA作为模板进行RT-LAMP的特异性检测，结果显示仅有SMYEV的RNA能够扩增出瀑布型条带，建立的RT-LAMP检测体系有很好的特异性。将SMYEV的RNA原液、10-1、10-2、10-3稀释液作为模板进行RT-PCR反应后，检测结果为阳性，随着模板稀释倍数的增加，电泳检测不能观察到RT-PCR的扩增产物。而进行SMYEV的RT-LAMP检测时，RNA原液、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5稀释液作为模板时，均可以观察到阳性结果。RT-LAMP检测SMYEV比RT-PCR方法检测的灵敏度高100倍，并且比RT-PCR节省时间，检测结果容易判定。【结论】RT-LAMP方法能快速、简便、特异地检测SMYEV，供科研部门和基层生产单位使用，在种苗繁育、田间调查和海关检疫的过程中进行快速检测。