解淀粉芽孢杆菌pyrR基因敲除载体的构建

• 作者: 于丽男 何建国 刘慧燕 吴庆 方海田 王梦娇 贺晓光
• 来源期刊: 南方农业学报
• 关键词: 解淀粉芽孢杆菌 pyrR基因 基因敲除 温敏型敲除载体 胞苷
• 年，卷（期）: 2015,（8）
• 所属期刊栏目: 作物遗传育种·种质资源·分子生物学
• 页码范围: 1339-1344
• 页数: 6页
• 分类号: Q786
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j:issn.2095-1191.2015.08.1339

摘要

[目的]构建用于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)pyrR基因敲除的温敏型敲除载体,为研究pyrR蛋白缺失对胞苷合成的影响奠定基础.[方法]设计并合成含有限制性内切酶酶切位点的引物,以解淀粉芽孢杆菌基因组DNA为模板,利用PCR分别扩增pyrR基因的上游同源序列和下游同源序列,再定向克隆至含卡那抗性基因的pKS1温敏型载体上,构建敲除载体pKS 1-pyrR.[结果]经特异性引物对pyrR-S 1/pyrR-A1和pyrR-S2/pyrR-A2扩增,获得解淀粉芽孢杆菌目的DNA片段pyrR-up和pyrR-down,大小约500 bp;目的片段经克隆载体pMD 19-T连接、Trans 1-T1转化,获得的重组质粒分别以Kpn Ⅰ/Hind Ⅲ、Pst Ⅰ/NotⅠ双酶切鉴定和测序后,可获得大小约500 bp的上、下游克隆载体T-pyrR-up和T-pyrR-down.上游克隆载体T-pyrR-up经Kpn Ⅰ与Hind Ⅲ双酶切及T4 DNA连接、Trans1-T1转化后,进行重组载体检测和质粒双酶切鉴定,得到大小分别为433、5064 bp的片段,与连接长度一致,构建获得带标记基因的重组载体pKS 1-pyrR-up.采用PstⅠ和NotⅠ对T-pyrR-down和pKS 1-pyrR-up同时进行双酶切,经连接、转化、双酶切鉴定后,得到两条长度分别为446和5497 bp的片段,与连接前长度一致,证明pyrR的上、下游同源臂已正确插入到pKS1载体中,获得敲除载体pKS 1-pyrR.[结论]构建的解淀粉芽孢杆菌pyrR基因敲除载体pKS1-pyrR可用于研究敲除pyrR基因及pyrR蛋白缺失对胞苷过量合成的影响.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	方海田	宁夏大学农学院	41	250	8.0	14.0
2	刘慧燕	宁夏大学农学院	35	191	7.0	12.0
3	何建国	宁夏大学农学院	93	716	16.0	22.0
4	贺晓光	宁夏大学农学院	101	605	13.0	19.0
5	于丽男	宁夏大学农学院	4	8	2.0	2.0
6	吴庆	宁夏大学农学院	10	23	4.0	4.0
7	王梦娇	宁夏大学农学院	7	23	4.0	4.0