里氏木霉Cel5A基因优化及其在毕赤酵母中的高效表达

• 作者: 孙付保 张云博 张喆 张斐洋 张震宇 王春迪 白仁惠
• 来源期刊: 生物工程学报
• 关键词: 毕赤酵母GS115-EG Ⅱ 里氏木霉Cel5A基因 AOX1启动子 密码子偏好性 发酵优化 CMC酶活
• 年，卷（期）: 2016,（10）
• 所属期刊栏目: 工业生物技术
• 页码范围: 1381-1394
• 语种: 中文
• DOI: 10.13345/j.cjb.160017

摘要

内切纤维素酶Cel5A缺乏是限制纤维素酶制剂高效酶解天然纤维素的关键因素.本文尝试构建高效表达里氏木霉Cel5A的毕赤酵母重组菌株以弥补目前Cel5A的天然分泌不足,通过基因密码子偏好性优化里氏木霉Cel5A基因和构建表达载体pPIC9K-eg2,并将其电转入毕赤酵母GS115以构建重组子,利用浓度梯度平板和摇瓶发酵筛选获得一株高产毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115-EG Ⅱ.重组酶的酶学性质分析显示,该酶分子量50 kDa、最适pH (pH 4.5)略有降低及最适反应温度为60℃,专一性地作用于非结晶纤维素,与天然里氏木霉Cel5A并无明显区别.通过摇瓶发酵的初步优化,该菌摇瓶培养条件:培养温度28℃、起始pH 5.0、接种量2％、每24 h添加甲醇1.5％(V/V)、每24 h添加山梨醇4 g/L及吐温80添加4g/L,发酵192 h重组酶酶活达到24.0 U/mL.进一步上罐(5 L)发酵180 h,该重组酶Cel5A酶活高达270.9 U/mL,蛋白含量达到4.16 g/L.重组毕赤酵母P.pastoris GS115-EG Ⅱ是一株适合于外源表达Cel5A的工程菌,该重组酶可替代天然分泌Cel5A适用于当前酶基生物炼制模式下木质纤维素基质高效水解中.