融合Strep-tag Ⅱ标签灵杆菌核酸酶的重组表达与催化特性分析

• 作者: 吕宁 李学俊 陈鹏
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 灵杆菌核酸酶 Strep-tag Ⅱ 包涵体 去除系统
• 年，卷（期）: 2016,（6）
• 所属期刊栏目: 研究论文与报告
• 页码范围: 899-907
• 分类号: Q789
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2016.06.013

摘要

灵杆菌(Serratia marcescens)核酸酶高效的核酸去除能力与较强的稳定性使其在生物医药领域有广泛的应用,而如何高效去除反应体系中添加的微量核酸酶成为了重要的生产问题.为建立反应后核酸酶的快速去除系统,本研究构建了融合Strep-tagⅡ标签的灵杆菌非特异核酸酶(Strep-tag Ⅱfused non-specific nuclease,SNU),并对融合蛋白的催化特性以及去除效果进行分析.依据灵杆菌核酸酶基因序列,设计融合Strep-tagⅡ编码序列的引物克隆目标基因并构建融合表达载体pLLP-OmpA+snu,并将测序正确的重组质粒转化宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli) BL21并进行诱导表达.融合Strep-tag Ⅱ的核酸酶以包涵体形式过量表达,通过优化包涵体纯化条件获得高纯度包涵体.经包涵体复性可获得高活性的融合蛋白,复性率大于60％.复性蛋白经二乙氨基乙基(diethylaminoethyl,DEAE)-琼脂糖凝胶(sepharose)阴离子交换层析进一步纯化获得了高纯度的融合蛋白.融合蛋白的纯化效率可以达到18.695 mg/L.活性检测表明该融合蛋白能够高效降解DNA与RNA,其最适温度为37℃,最适pH为8.0,比活力达到1.53×105 U/mg.500 mmol/L以下尿素对酶活性几乎没有影响,而高于50 mmol/L MgC12、大于2 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)则会对活性产生一定的抑制作用.不同二价金属离子对酶活性影响的分析表明,Mg2+和Mn2+对重组核酸酶活性有明显的促进作用,Zn2+、Cu2+和Ca2+则没有促进作用,而Co2+、Ni2+和Fe2+对重组核酸酶的活性促进不显著.通过链霉亲和素(Streptavidin)-Sepharose CL 6B能够实现融合Strep-tagⅡ标签的核酸酶的高效去除.融合Strep-tagⅡ标签的灵杆菌非特异核酸酶的重组表达、包涵体纯化-复性体系以及去除系统的建立为灵杆菌非特异核酸酶的实践应用提供了基础资料.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	李学俊	西北农林科技大学生命科学学院	28	542	9.0	23.0
2	陈鹏	西北农林科技大学生命科学学院	65	668	14.0	23.0
3	吕宁	西北农林科技大学生命科学学院	2	3	1.0	1.0