肝片吸虫 Fh8明显增强 STEC 的 Stx1可溶性表达及 Stx1单克隆抗体制备

• 作者: 何孔旺 张强 张碧成 张雪寒 汪伟
• 来源期刊: 华北农学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 产志贺毒素大肠杆菌 志贺毒素 1 肝片吸虫 Fh8 可溶性表达 单克隆抗体
• 年，卷（期）: 2016,（5）
• 页码范围: 44-49
• 页数: 6页
• 分类号: Q78
• 字数: 4038字
• 语种: 中文
• DOI: 10.7668/hbnxb.2016.05.007

摘要

志贺毒素1（Shiga toxin 1，Stx1），系五聚体蛋白，是产志贺毒素性大肠杆菌（Shiga Toxin-producing Escherichia coli，STEC）主要的毒素因子，但 Stx1体外极不易可溶性表达，旨在克隆和表达志贺毒素1（Shiga toxin 1，Stx1）A 亚基，体外获得可溶性表达的 Stx1，以研制单克隆抗体。生物信息学软件分析 Stx1 A 亚基氨基酸序列，Stx1 A1亚基 N 端为信号肽段，其 C 端高疏水性和低免疫原性。PCR 扩增 stx1A 亚基73～759的687个核苷酸，与肝片吸虫 Fh8基因串联，克隆到低温表达载体 pCold Ⅰ以构建重组菌，诱导表达重组毒素 His-Fh8-Stx1 A，SDS-PAGE 分析蛋白表达形式。重组毒素 His-Fh8-Stx1 A 免疫 Balb ／c 小鼠，Sp2／0细胞融合筛选、制备阳性杂交瘤和单克隆抗体。PCR 扩增 Fh8和 stx1a 亚基并构建重组质粒 pCold Ⅰ-His-Fh8-stx1，重组蛋白在原核细胞中得到高效表达，且以可溶性形式存在于菌体胞浆中。以重组 His-Fh8-Stx1 A 为免疫原，成功制备3株能稳定传代并分泌 Stx1的单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞株，取其中1株成功制备高 ELISA 效价的腹水。Western Blot 显示，纯化的单克隆抗体可与重组免疫原 His-Stx1 A 和天然志贺毒素1发生特异性反应。本试验成功可溶性表达志贺毒素1 A 亚基，并获得多株单克隆抗体，为研制用于检测 STEC 的夹心 ELISA 和胶体金试纸条奠定理论基础。