Vsig4和免疫球蛋白Fc段融合蛋白的真核表达纯化

• 作者: 张富军 温玉荣 罗思羽 郑芳 韩燕
• 来源期刊: 现代生物医学进展
• 学科: 医学
• 关键词: Vsig4-Fc 融合蛋白 真核蛋白表达 蛋白质纯化 重合延伸PCR
• 年，卷（期）: 2016,（26）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 5001-5005,5134
• 分类号: Q78|R-33
• 语种: 中文
• DOI: 10.13241/j.cnki.pmb.2016.26.001

摘要

目的:本项目将通过构建中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)真核表达系统获取小鼠Vsig4膜外端和免疫球蛋白IgG3a-Fc段的融合蛋白,鉴定Vsig4-Fc和Vsig4纳米抗体的相互作用.方法:采用重合延伸PCR法融合小鼠IgG3a-Fc和Vsig4胞外段的基因序列,将该融合基因插入真核表达载体中并转染CHO细胞.Western blotting鉴定转染细胞上清中的目标蛋白,通过连续两次亚克隆筛选,获得高表达小鼠Vsig4-Fc融合蛋白的单克隆,之后大量培养增殖转染细胞并收集细胞培养上清,选择Protein A柱纯化方法纯化Vsig4-Fc蛋白,最后经ELISA法鉴定Vsig4-Fc和纳米抗体的结合能力.结果:在CHO细胞中成功构建了小鼠Vsig4-Fc真核表达稳转系,并且在真核表达体系中获得可表达15 mg/L的双分子结构Vsig4-Fc的稳定转染细胞系.经鉴定小鼠Vsig4-Fc融合蛋白能与Vsig4纳米抗体结合.结论:重合延伸PCR法使得Vsig4和Fc基因片段的融合更为高效,两次亚克隆筛选优势细胞系大幅提高了真核蛋白的表达量,为进一步研究Vsig4的生物学功能奠定重要基础.