CRISPR/Cas9介导的ASGR1基因敲除猪制备

• 作者: 冯冲 曾国敏 李西睿 潘登科 石宁宁 纪慧丽 蒋应弟 魏静 龙川
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 规律成簇间隔短回文重复(CRISPR/Cas9) 去唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1) 异种肝移植 体细胞核移植 基因敲除猪
• 年，卷（期）: 2016,（8）
• 所属期刊栏目: 专题:动物基因编辑技术
• 页码范围: 1243-1250
• 分类号: S8
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2016.08.016

摘要

猪(Sus scrofa)内皮细胞的去唾液酸糖蛋白受体1(asialoglycoprotein receptor 1,ASGR1)是诱发异种肝移植后受体发生血小板减少症的主要诱因之一.本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除的五指山小型猪基础上,利用规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9)结合体细胞核移植技术制备ASGR1基因敲除猪,针对猪ASGR1基因设计并构建了靶向表达载体单链导向RNAl (single guide RNA1,sgRNA1),将sgRNA1与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)质粒共同电转染GGTA1基因敲除猪耳成纤维细胞,流式细胞仪富集筛选带绿色荧光的细胞后培养单细胞克隆.实验结果表明,PCR测序检测培养获得的41个单细胞克隆,37个克隆发生基因突变,ASGR1基因突变效率为90％,其中双等位基因敲除的细胞克隆30个,效率高达73％.选择4个ASGR1基因敲除类型不同的细胞为核供体进行核移植,将早期重构胚移植到4头受体猪,2头妊娠至终期,产仔猪6头,Western blot显示ASGR1基因敲除仔猪的肝脏中没有ASGR1的表达.对sgRNA1的13个潜在脱靶位点,分别设计引物进行PCR扩增和测序,结果显示没有脱靶现象.总之,本研究利用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术快速高效地制备了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,有望解决异种肝移植后出现的血小板减少症,为临床过渡肝的应用研究提供了良好的研究材料.