MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白原核表达载体的构建与蛋白制备

• 作者: 吴胤瑛 李恩孝 李毅 王举波 耿倩倩 董丹凤
• 来源期刊: 现代肿瘤医学
• 学科: 医学
• 关键词: 鼠双微体2 鼠双微体4 p53 硫氧还蛋白 蛋白转导域
• 年，卷（期）: 2016,（6）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 865-870
• 页数: 6页
• 分类号: R73-3
• 字数: 6560字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1672-4992.2016.06.005

摘要

目的:采用分子克隆技术和大肠杆菌原核表达系统制备具备生物学活性MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白.方法:首先应用PCR合成大肠杆菌硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)A的cDNA序列,将其插入到大肠杆菌原核表达载体pET40b中,将人工合成的人免疫缺陷病毒(human immuno-deficiency virus,HIV-1)反式激活蛋白(transactivator,TAT)的蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)和MDM2/4双抑制肽pDI(peptide double inhibition)的cDNA序列分别插入到Trx序列的C端和核心位点,从而构建出可表达MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白的原核表达载体pET-TAT-TrxA-pDI.然后将pET-TAT-TrxA-pDI原核表达载体转化大肠杆菌表达菌种BL21感受态细胞,应用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导蛋白表达,筛选最优表达的单克隆菌种,分析重组蛋白的表达部位,并了解不同IPTG浓度(0.1 mmol/L、0.4mmol/L、0.7mmol/L、1.0mmol/L)、温度(16℃、25℃、37℃)、表达诱导时间(1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h)对MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白表达的影响,以获得最优的蛋白表达条件.最终利用MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白携带的His标签,采用能够特异性结合His标签的蛋白纯化柱进行蛋白纯化,并应用梯度透析法和氧化还原法进行MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白的体外折叠.结果:成功构建可以表达MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白的原核表达载体pET-TAT-TrxA-pDI,并实现MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白在大肠杆菌表达菌种BL21(DE3)中的高效表达,表达量占总蛋白表达量的60％以上,并且主要存在于包涵体中.蛋白表达条件优化结果发现,温度对重组蛋白表达无明显影响,而应用0.4mmol/L的IPTG浓度和3h的诱导时间即可获得重组蛋白的高效表达.经过蛋白纯化后获得纯度99.99％的重组蛋白,将纯化的MDM2/MDM4双靶点抑制蛋白溶液用梯度透析复性和氧化还原复性法最终成功获得包涵体蛋白的体外正确折叠,复性效率约为80％.结论:成功实现MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白在大肠杆菌原核表达系统中的高效表达、纯化以及体外的正确折叠,最终获得高纯度并具有生物学活性的MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白,从而为进一步MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白抗肿瘤活性与机制的研究奠定了基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	李恩孝	西安交通大学第一附属医院肿瘤内科	46	319	10.0	16.0
2	李毅	西安交通大学第一附属医院肿瘤内科	132	612	13.0	19.0
3	王举波	西安交通大学第二附属医院神经外科	17	64	3.0	8.0
4	董丹凤	西安交通大学第一附属医院肿瘤内科	23	47	4.0	6.0
5	吴胤瑛	西安交通大学第一附属医院肿瘤内科	21	174	5.0	13.0
6	耿倩倩	西安交通大学第一附属医院肿瘤内科	6	1	1.0	1.0