猪miR-192对DLG5和ALCAM基因的靶向作用关系验证

• 作者: 包文斌 吴嘉韵 吴圣龙 吴森 孙丽 赵呈祥
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 猪 miRNA-192 活化白细胞黏附分子基因(ALCAM) Discs大同源物基因(DLG5) 腹泻
• 年，卷（期）: 2017,（9）
• 所属期刊栏目: 研究论文与报告
• 页码范围: 1451-1459
• 页数: 9页
• 分类号: S857.3
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2017.09.008

摘要

在生理病理过程中,microRNAs(miRNAs)通过作用于相应靶基因发挥着重要的作用.通过高通量测序结合荧光定量实验验证,本课题组前期初步确定miR-192靶向调控Discs大同源物(discs large homolog 5,DLG5)和活化白细胞黏附分子(activated leukocyte cell adhesion molecule,ALCAM)基因在断奶仔猪抗大肠杆菌(Escherichia coli)感染过程中发挥了重要的作用.本研究采用双荧光素酶报告系统和Western blot方法,验证DLG5和ALCAM基因是否受到miR-192的特异性调控.构建含有靶基因位点的荧光素酶报告基因重组载体,与PRL-TK和miRNA-192模拟物mimics、inhibitor或阴性对照共转染293细胞,24h后收集细胞检测荧光素酶活性和靶基因蛋白表达变化.同时检测3种大肠杆菌感染肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IPEC-J2)后靶基因的表达变化.本研究成功获得荧光素酶报告基因重组载体,荧光结果显示,miRNA-192 mimics显著抑制2个报告重组载体的荧光素酶活性(P＜0.05),而miRNA-192inhibitor则显著促进2个报告重组载体的荧光素酶活性(P＜0.05).同时,miRNA-192模拟物处理组靶基因DLG5和ALCAM蛋白水平极显著低于阴性对照组,再次验证了上述结果.3种大肠杆菌感染后,2个靶基因的表达均显著或极显著上升.由结果可知,猪miR-192对DLG5和ALCAM基因具有靶向抑制作用,且DLG5和ALCAM基因的表达确实与大肠杆菌感染有关.本研究结果为miR-192及其靶基因在断奶仔猪抵抗F18大肠杆菌感染过程中的功能和调控机制相关研究提供了一定的实验基础和理论依据,进一步为猪抗大肠杆菌病有效遗传标记的筛选提供了科学依据.