microRNA-133b过表达载体的构建及在E ca 109细胞的表达鉴定

• 作者: 伊力扎提·艾买提江 伊力旦·热合曼 刘伊宁 加米拉·扎衣顿 库尔班江·托合提 廉思谊 李卉 李惠武 阿拉法特·卡哈尔
• 来源期刊: 新疆医科大学学报
• 学科: 生物学
• 关键词: RNA干扰 慢病毒 微小 RNA133b(miR-133b) DNA过表达载体 Eca109 细胞
• 年，卷（期）: 2017,（1）
• 所属期刊栏目: 基础医学研究
• 页码范围: 66-70
• 页数: 5页
• 分类号: Q291
• 字数: 2568字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1009-5551.2017.01.017

摘要

目的：构建携带 Human Hsa-mir-133b 基因的 miRNA 干扰慢病毒载体（plKD-Ubc-eGFP-U6-shRNA），并成功转染食管癌 Eca109细胞株。为研究微小 RNA133b（miR-133b）对食管癌 Eca109细胞的作用奠定基础。方法凭据 Human Hsa-miR-133b基因的转录目录，设计 shRNA的靶点并进行引物的合成。将单链的引物退火成带粘性末端的双链片段，将其衔接于双酶切的 RNA干扰载体，替换原有的 ccdB毒性基因，用重组的质粒转染感受态细胞，并测定序列。筛选出来的阳性克隆即为 miR-133b的干扰载体质粒。提取测序结果准确的克隆里含有的载体质粒。将重组的载体质粒转染至食管癌 Eca109细胞。结果成功构建了 miR-133b干扰慢病毒载体，重组质粒进行PCR鉴定及序列测定证实DNA oligo成功连到载体中，并实现食管癌 ECA109细胞中重组载体质粒的稳定转染。在荧光倒置显微镜下分别观察到重组空载体组转染的 Eca109细胞和过表达载体组转染的Eca109细胞发出不同强度的带有绿色荧光的信号。结论该实验成功构建了人 miR-133b基因的干扰慢病毒载体，采取脂质体法对食管癌 Eca109细胞进行质粒转染，获得高表达，为进一步研究 miR-133b 的功能奠定牢固的基础。