I-Ad/IgG2b Fc二聚体融合蛋白的构建表达及鉴定

• 作者: 徐成伟 罗智环 钱航 闵新文 陈俊
• 来源期刊: 中国免疫学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: I-Ad 二聚体 昆虫细胞 杆状病毒表达载体
• 年，卷（期）: 2017,（4）
• 所属期刊栏目: 基础免疫学
• 页码范围: 498-501,506
• 页数: 5页
• 分类号: R392.1
• 字数: 2500字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.004

摘要

目的:构建I-Ad/IgG2b Fc杆状病毒表达载体,使其在Sf9昆虫细胞内表达.方法:利用RT-PCR从BALB/c小鼠淋巴细胞中扩增出I-Ad α、I-Ad β和IgG2b Fc目的基因序列,运用重叠PCR将I-Ad α和I-Ad β分别与Fos和Jun的亮氨酸拉链序列相连,形成I-Ad α-Fos和I-Ad β-Jun;利用酶切位点XbaⅠ将I-Ad α-Fos与IgG2b Fc段相连,形成I-Ad α-Fos-IgG2b Fc重组序列;分别将I-Ad α-Fos-IgG2b Fc和I-Ad β-Jun插入杆状病毒表达载体pFastBacTMDual的PPH和PP10两个启动子的下游,构建出重组载体pFastBacTMDual+[I-Ad/IgG2b Fc];采用PCR及限制性内切酶对所构建的载体进行鉴定并测序;将pFastBacTMDual+[I-Ad/IgG2b Fc]转入DH10Bac感受态,使其在转座子的作用下形成重组杆粒病毒Bacmid+[I-Ad/IgG2b Fc],利用脂质体转染试剂将重组表达载体转染至Sf9昆虫细胞,P4后大量感染Sf9昆虫细胞,收集上清通过PEG20000浓缩可得到I-Ad/IgG2b Fc二聚体融合蛋白,通过双抗体夹心ELISA及Western blot对表达的蛋白进行检测.结果:PCR及酶切鉴定以及测序结果证实所构建的pFastBacTMDual+[I-Ad/IgG2b Fc]重组载体具有正确的序列;双抗体夹心 ELISA和Western blot结果表明重组杆粒能成功感染Sf9昆虫细胞,并且表达的融合蛋白具有正确构象.结论:成功构建pFastBacTMDual+[I-Ad/IgG2b Fc]杆状病毒表达载体,并在Sf9昆虫细胞中表达,为研究I-Ad限制性的T细胞奠定了基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	陈俊		20	72	5.0	8.0
2	闵新文		31	175	6.0	12.0
3	钱航		11	20	3.0	4.0
4	徐成伟		2	0	0.0	0.0
5	罗智环		2	2	1.0	1.0