一个新的L-半胱亚磺酸脱羧酶基因的分析和突变

• 作者: 吴巧芬 徐悦 欧倩 武波 蒋承建 邓洁 高华
• 来源期刊: 微生物学报
• 关键词: 牛磺酸 L-半胱亚磺酸脱羧酶 宏基因组文库 连续易错PCR技术 突变酶
• 年，卷（期）: 2017,（8）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 1283-1292
• 页数: 10页
• 语种: 中文
• DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20170133

摘要

[目的]完成一个来源于碱性污染土壤宏基因组文库的新的L-半胱亚磺酸脱羧酶基因undeclA的鉴定,研究其酶学性质并利用非理性设计技术对其进行分子改造.[方法]以pETBlue-2为表达载体构建包含undeclA基因的重组表达质粒,转化至宿主细胞E.coli Tuner (DE3) pLacI中构建重组表达克隆,采用镍亲和层析完成了酶蛋白的分离纯化,完成其生化特征研究,利用连续易错PCR技术对Undec lA蛋白进行分子改造.[结果]生物信息学分析结果揭示UndeclA蛋白与已知的L-半胱亚磺酸脱羧酶存在类似的辅酶结合位点和底物识别催化基序等.分子对接结果显示氨基酸残基Va1237、Asp239、Asp266、Ile267、A1a268和Lys298等决定了与底物分子L-半胱亚磺酸的识别和结合催化.以L-半胱亚磺酸作为底物,重组UndeclA蛋白的最适作用pH为7.0,最适作用温度为35℃;分子动力学常数Km为(1.557±0.015) mmol/L,Vmax为(49.07±3.19) μmol/(L.min),kcat为(45.80±1.32)/min.利用连续易错PCR技术完成了亲本酶的分子改造,分离筛选到了一个酶活力更高的突变酶UndeclA-1180.在优化条件下,UndeclA-1180的比活力较亲本酶提高了约5.62倍.[结论]本研究为构建牛磺酸的生物合成工艺提供了理论参考,因而具有重要的实践意义.