利用CRISPR/Cas9技术制备B2M–细胞模型

• 作者: 李戊玲 沈俊杰 钱程
• 来源期刊: 中国细胞生物学学报
• 关键词: B2M CRISPR/Cas9 HEK293 电穿孔 脱靶
• 年，卷（期）: 2018,（8）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 1326-1333
• 页数: 8页
• 语种: 中文
• DOI: 10.11844/cjcb.2018.08.0033

摘要

I型主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex class I, MHC I)是造成免疫排斥的重要分子, 该研究利用CRISPR/Cas9(clustered regularly interspersed short palindromic repeats)技术靶向其β2微球蛋白(beta-2 microglobulin, B2M)亚基实现MHC I的敲除, 并在分子和细胞水平进行验证.设计针对B2M基因的gRNA(guide RNA)并构建对应的CRISPR/Cas9基因敲除质粒, 通过电穿孔转染技术将同时带有Cas9蛋白与gRNA骨架的质粒瞬时转入HEK293细胞中进行蛋白表达与基因组核酸切割, 流式分选得到HEK293 B2M阴性细胞, 提取其基因组并对gRNA靶向区域与脱靶区域进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR), 将PCR产物连接T载体测序检测基因打靶与脱靶情况.同时, 利用反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)与实时定量荧光聚合酶链式反应(Real-time polymerase chain reaction, Real-time PCR)测定B2M基因在RNA水平的表达.综上所述, 该研究发现了一种利用CRISPR/Cas9技术快速便捷、低成本的可用于敲除B2M基因的方法, 经检测可使目的细胞中B2M基因发生移码、插入、缺失、单碱基突变, 且未发现脱靶现象, 这在未来解决免疫排斥相关难题上意义重大.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	钱程		74	233	9.0	13.0
2	李戊玲		1	0	0.0	0.0
3	沈俊杰		8	9	2.0	3.0