piggyBac转座子介导HepG2细胞不同亚型药物代谢酶稳定共表达方法比较

• 作者: 庞士慧 戴仁科 李浩健 谢水林 贾英 邹淑香 钟国瑞 黄黎珍
• 来源期刊: 中国药理学与毒理学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: piggyBac转座子 HepG2细胞 药物代谢酶 多基因共表达
• 年，卷（期）: 2018,（2）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 125-134
• 页数: 10页
• 分类号: R969.1
• 字数: 7410字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3867/j.issn.1000-3002.2018.02.007

摘要

目的 在piggyBac(PB)转座子介导下,探索在HepG2细胞中实现多个药物代谢酶稳定共表达的策略,为建立体外药物代谢和肝毒性研究的理想细胞模型奠定基础.方法 首先选择3种目前针对大片段DNA使用较广的转染方法:Lipofectamine?LTX,GenJetTM(Ver.Ⅱ)和Neon?Transfection System,分别转染N端标记增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-N2)和2A串联重组细胞色素3A4(CYP3A4)和CYP2C19的PB转座子质粒(pPB-CYP3A4-2A-2C19)至HepG2细胞,48 h后比较不同方法的转染效率和细胞毒性,确立高效低毒的HepG2细胞转染方法.然后选择该法进行转染,将设计的3组PB重组转座子:单基因转座子(PB-CYP3A4)、2A串联多基因转座子(PB-CYP3A4-2A-2C19)、多个单基因转座子混合物〔PB-CYP3A4, PB-CYP2C8,PB-CYP2A6,有机阴离子转运多肽1B1的PB转座子(PB-OATP1B1)〕分别转染HepG2细胞,利用嘌呤霉素和GFP进行单克隆细胞筛选:挑选具有抗性且表达GFP的细胞单克隆并进行扩大培养,采用实时荧光定量PCR、Western蛋白质印迹和高效液相色谱-串联质谱联用法分别检测各组药物代谢酶mRNA、蛋白质水平及酶活性,并进行统计分析.结果 3种转染方法比较发现,GenJetTM法的转染效率显著高于其他2种(P<0.01),介导Pegfp-N2和Ppb-CYP3A4-2A-2C19的转染效率分别高达(94.2±2.5)%和(89.3±3.3)%,且该法具有较低的细胞毒性.因此选择GenJetTM法进行后续PB转座子转染.分别转染3组PB重组转座子发现,单个转座子PB-CYP3A4和PB-CYP3A4-2A-2C19转染后,筛选获得的抗性细胞克隆中各个药物代谢酶在Mrna、蛋白质及活性水平均显著提高,其中2A可实现CYP3A4和CYP2C19药物代谢酶协同稳定表达;而多个转座子混合共转染细胞中,仅有随机几个基因表达;且各药物代谢酶基因的表达不均衡,仅CYP3A4药物代谢酶基因在单克隆细胞中表达水平明显升高.结论 GenJetTM法可成为PB重组转座子转染HepG2细胞的有效方法.PB转座子可介导基因稳定表达;但在实现多基因共表达时,与病毒载体法不同,理论上可行的PB多转座子共转染方法其基因表达效率下降,且各基因表达不均衡.相比之下,应用2A串联多个基因串联重组PB单转座子可实现各基因稳定表达.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	谢水林	华南理工大学生物科学与工程学院	5	5	1.0	2.0
2	戴仁科	华南理工大学生物科学与工程学院	9	10	2.0	2.0
3	庞士慧	华南理工大学生物科学与工程学院	1	1	1.0	1.0
4	钟国瑞	华南理工大学生物科学与工程学院	1	1	1.0	1.0
5	李浩健	华南理工大学生物科学与工程学院	1	1	1.0	1.0
6	邹淑香	华南理工大学生物科学与工程学院	2	1	1.0	1.0
7	贾英	华南理工大学生物科学与工程学院	2	1	1.0	1.0