PK-15细胞中与CSFV感染相关的microRNAs筛选及miR-214的功能研究

• 作者: 叶佐东 张静远 朱梦娇 范双旗 赵明秋 邓少锋 陈金顶
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 猪瘟病毒 miRNA 复制 TRADD 凋亡
• 年，卷（期）: 2018,（21）
• 所属期刊栏目: 专题:猪瘟与非洲猪瘟
• 页码范围: 4157-4168
• 页数: 12页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2018.21.014

摘要

[目的]利用制作的猪的miRNA表达谱芯片筛选猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)感染PK-15细胞后表达有差异的miRNA,并进一步探讨其中表达差异较明显的miRNA的作用和功能,从miRNA的角度探究CSFV的致病机制,为猪瘟(classical swine fever,CSF)的防控提供新依据.[方法]为了研究CSFV感染PK-15细胞后miRNA表达的变化情况,根据miRBase version 19.0数据库中326条猪的miRNA合成探针,采用原位合成技术制作表达谱芯片,筛选得到CSFV感染PK-15细胞后表达有差异的miRNA.挑选CSFV感染PK-15细胞后表达差异最明显的miR-214作为进一步研究对象,研究miR-214在CSFV感染过程中的功能和作用.CSFV感染PK-15细胞后,用荧光定量PCR检测miR-214的mRNA表达水平.为了进一步研究miR-214对CSFV感染的影响,合成miR-214模拟物及抑制物,并分别转染PK-15细胞,转染后24 h感染CSFV,感染后48h用荧光定量PCR检测CSFV的基因拷贝数,用间接免疫荧光方法检测CSFV的病毒滴度.为了进一步探究miR-214参与调控CSFV复制的机制,通过生物信息学软件预测miR-214参与调控CSFV复制的靶蛋白,并用荧光素酶报告基因系统进一步确证miR-214能够靶向作用于凋亡通路中重要分子TNFR1相关的死亡区域蛋白(TNF Receptor-Associated Death Domain,TRADD),因此猜测miR-214通过影响靶蛋白TRADD的表达水平从而影响PK-15细胞凋亡,将miR-214模拟物及抑制物分别转染PK-15细胞,转染后24 h感染CSFV,同步设立不感染CSFV的细胞对照,感染后48 h用荧光定量PCR和Western blot分别检测TRADD的mRNA和蛋白表达量的变化,同时用流式细胞术检测miR-214对CSFV感染的PK-15细胞凋亡的影响.[结果]CSFV感染PK-15细胞后,通过表达谱芯片技术筛选得到69条表达有差异的miRNA,其中miR-214表达量上调且差异最明显.qRT-PCR结果显示,CSFV感染PK-15细胞后miR-214的mRNA表达量上调,验证了表达谱芯片的结果.将miR-214模拟物转染PK-15细胞后再感染CSFV,CSFV的基因拷贝数及病毒滴度均显著下降;转染miR-214抑制物后再感染CSFV,CSFV的基因拷贝数及病毒滴度均显著上升,表明miR-214促进了CSFV的复制.为了进一步探究miR-214促进CSFV复制的机制,用生物信息学软件预测TRADD为miR-214的靶蛋白,荧光素酶报告基因系统验证了miR-214能够靶向作用于TRADD.转染miR-214模拟物后,PK-15细胞中TRADD的mRNA和蛋白表达量均显著上升,而转染miR-214抑制物后,PK-15细胞中TRADD的mRNA和蛋白表达量均显著下降,表明miR-214抑制TRADD的表达.通过流式细胞术,验证了CSFV感染PK-15抑制细胞凋亡,miR-214抑制CSFV感染的PK-15细胞凋亡.[结论]CSFV感染PK-15后,上调细胞内miR-214的表达.miR-214能通过靶向抑制TRADD蛋白的表达,从而抑制PK-15细胞凋亡,促进CSFV在细胞内的复制.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	陈金顶	华南农业大学兽医学院	58	491	10.0	21.0
2	赵明秋	华南农业大学兽医学院	39	256	7.0	15.0
3	范双旗	华南农业大学兽医学院	3	3	1.0	1.0
4	朱梦娇	华南农业大学兽医学院	3	3	1.0	1.0
5	叶佐东	华南农业大学兽医学院	2	21	2.0	2.0
6	邓少锋	华南农业大学兽医学院	1	3	1.0	1.0
7	张静远	华南农业大学兽医学院	1	3	1.0	1.0