大豆GmWRKY14的克隆与功能分析

• 作者: 崔晓霞 王莎莎 轩慧冬 邢邯 郭娜 黄颜众
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 大豆 GmWRKY148 大豆疫霉根腐病 抗性
• 年，卷（期）: 2018,（18）
• 所属期刊栏目: 作物遗传育种·种质资源·分子遗传学
• 页码范围: 3445-3454
• 页数: 10页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2018.18.002

摘要

[目的]WRKY转录因子与植物的生物和非生物胁迫应答密切相关.通过对大豆WRKY转录因子基因GmWRKY148的克隆及在大豆发状根中过表达后对疫霉根腐病抗性的分析,探究大豆与大豆疫霉菌互作的作用机理.[方法]以拟南芥的AtWRKY44序列为探针,利用同源克隆的方法在大豆Williams 82的根部组织中得到其同源基因Glyma.14G199800,命名为GmWRKY148.对GmWRKY148蛋白进行系统进化树分析;利用qRT-PCR方法分析该基因在大豆的根、茎、叶、子叶和接种大豆疫霉菌不同时间点的转录水平;利用双酶切的方法将GmWRKY148完整的CDS序列连接到植物过表达载体pBinGFP2中,利用基因枪法将重组质粒转化到洋葱表皮细胞中,进行亚细胞定位分析.利用发根农杆菌K599介导的遗传转化体系,经过GFP荧光筛选和qRT-PCR检测,获得大豆过表达GmWRKY148的阳性发状根(OE-GmWRKY148)和转入pBinGFP2空载体(EV)的阴性对照发状根.对过表达GmWRKY148发状根和阴性对照发状根接种大豆疫霉菌,统计病斑长度、疫霉积累量和卵孢子萌发情况.[结果]GmWRKY148的CDS序列全长为999 bp,编码332个氨基酸,等电点为7.61.系统进化分析发现,GmWRKY148与菜豆(Phaseolus vulgaris)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的WRKY转录因子亲缘关系十分相近,且与菜豆的亲缘关系最近.亚细胞定位结果显示,GmWRKY148定位在细胞核中.组织表达分析显示,GmWRKY148在根中的表达量最高,在茎和叶中次之,在子叶中最低.荧光定量PCR结果表明,接种大豆疫霉菌P6497后,在感病品种Williams和抗病品种Williams 82(含有Rps1k)中,GmWRKY148受诱导逐渐上调表达,在侵染24 h后表达水平均达到最高,但在Williams 82中的上调倍数更高.对过表达GmWRKY148和转空载体的大豆阳性发状根分别接种大豆疫霉菌P6497的菌丝块,比较接种24 h后的病斑长度和疫霉积累量,结果显示,与对照EV相比,过表达GmWRKY148大豆阳性发状根的病斑长度显著变短,疫霉积累量显著降低.对过表达GmWRKY148和EV的大豆阳性发状根分别接种疫霉菌P6497的游动孢子,并在接种后24、36和48 h用显微镜观察菌丝的侵染及卵孢子萌发数量,统计结果显示,过表达GmWRKY148的大豆阳性发状根与对照EV相比,菌丝的侵染率及卵孢子萌发率均显著降低.[结论]GmWRKY148参与调控大豆与大豆疫霉的互作,能够增强大豆对大豆疫霉菌的抗性.