日本血吸虫SjELAV-like1的克隆、表达及功能分析

• 作者: 何川川 刘金明 古少鹏 张媛媛 李浩 李肖纯 程贵凤 许蓉 郭露 金亚美
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 日本血吸虫 SjELAV-like 1 原核表达 免疫定位 RNA干扰 电镜
• 年，卷（期）: 2018,（13）
• 所属期刊栏目: 畜牧·兽医·资源昆虫
• 页码范围: 2600-2613
• 页数: 14页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2018.13.015

摘要

[目的]克隆和表达日本血吸虫胚胎致死异常视觉基因1(SjELAV-like1),分析其在日本血吸虫体内的表达情况及定位,探究该基因对日本血吸虫形态和生殖发育的影响.[方法]利用RACE技术扩增5'/3'末端,获得SjELAV-1ike1基因序列提交至NCBI,Gene Bank登录号:MG515727,构建该序列的重组表达质粒pET28-SjELAV-like1,并在大肠杆菌BL21中利用IPTG诱导表达,收集不同诱导时间的菌体,SDS-PAGE法进行蛋白电泳.利用His镍柱亲和层析法纯化大量表达所得重组蛋白,用纯化重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用于Western blotting分析虫体内该天然蛋白的免疫原性,以及间接免疫荧光检测该蛋白在虫体内的分布情况.小鼠腹部贴片法感染日本血虫尾蚴,收集不同发育阶段混合虫体和合抱分开的雌、雄虫体,以单钉螺逸出的尾蚴感染小鼠获得25d单性雌、雄虫体,通过荧光定量PCR分析该基因的表达情况.通过尾静脉注射小干扰RNA(siRNA)于感染小鼠体内,使该基因表达沉默,筛选最佳干扰效果的siRNA,用于长期RNA干扰(RNAi)试验,分析其对日本血吸虫雌虫产卵及卵胚孵化的影响.利用扫描电镜和透射电镜观察RNAi对虫体体被结构及雌、雄虫生殖器官的影响.[结果]获得的1 797 bp的SjELAV-like 1基因序列含有poly A尾,其中编码序列为1 533 bp,编码51 0个氨基酸.重组质粒pET28-SjELAV-like1在诱导4h时表达量最高,主要以包涵体的形式存在,利用纯化蛋白获得了优质多抗,获得的重组蛋白具有良好的免疫原性,经分析发现SjELAV-like 1蛋白主要分布在虫体体被.荧光定量分析发现SjELAV-like1在不同时期雌、雄虫体内均有表达,在雄虫体内表达稳定,但在雌虫体内随着发育成熟其表达水平呈下降趋势;在不同感染状态的雌、雄虫体内,与正常发育雌虫相比,该基因在发育阻遏雌虫体内高表达,而在雄虫体内无明显差异.RNAi试验中,与NC组相比,长期干扰组小鼠肝减卵率、雌虫对肝卵贡献减少率和卵胚减孵化率分别为58.27％(P＜0.05)、40.59％(P＜ 0.01)和74.58％(P＜0.01);电镜观察发现,干扰组虫体体被结构改变,雄虫体表粘附的泡状物消失,立体的褶脊结构塌陷,整齐排列的条索状皮脊变的疏松,网状结构消失,雌虫体壁表面组织间隙增宽,分布于其上的体棘减少、变钝,雄虫精母细胞数目减少,其内的染色质减少,细胞肿大,细胞间隙增宽,雌虫卵黄细胞中卵黄球减少,其中包含的卵黄滴也减少,内质网肿大,皮质颗粒排列散乱.[结论]成功克隆和表达了在日本血吸虫发育阻遏雌虫中高表达的部分SjELAV-like 1基因序列,且该基因主要在虫体体被表达.该基因沉默使肝脏荷卵数、雌虫对肝卵贡献率和卵胚孵化率均显著降低,并改变虫体体被结构,抑制生殖腺的正常发育,提示该基因对日本血吸虫的生殖发育有重要的作用.