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番茄U6启动子的克隆及CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立
番茄U6启动子的克隆及CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立
作者:
刘晓东
刘超
李继洋
胡燕
蒲艳
阿尔祖古丽·塔什
基本信息来源于合作网站,原文需代理用户跳转至来源网站获取
CRISPR/Cas9
S1U6启动子
克隆
番茄
基因编辑
摘要:
[目的]从番茄中克隆高效转录的S1U6启动子,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,并在番茄中建立CRISPR/Cas9系统,为番茄功能基因组学和分子育种研究提供技术基础.[方法]采用PCR方法从‘中蔬四号’番茄品种中克隆4种S1U6启动子,利用Transfer PCR方法分别对4个启动子进行两种不同长度的截短,分别构建8个截短的S1U6启动子驱动GUS的植物融合表达载体.利用农杆菌瞬时转化法分别转染番茄叶片,通过GUS染色筛选出在番茄叶片中转录活性较高的S1U6-2启动子.采用DNA重组技术构建以S1U6-2为启动子驱动sgRNA,以番茄白粉病相关基因ML01和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体.载体构建成功后,采用PEG法转化番茄原生质体,提取基因组DNA,采用酶切/PCR法分析内源基因突变情况;采用测序法分析内源基因突变的类型.利用突变位点频率分布图来验证番茄内源启动子在番茄CRISPR/Cas9系统中的有效性.[结果]经过两轮PCR,共获得4种8个不同长度的番茄U6启动子,其长度分别是452、202、448、206、433、190、448和218 bp,启动子序列比对分析发现番茄U6启动子与拟南芥U6启动子一样,也含有比较保守的两个元件,USE和TATA框.成功构建了8个S1U6启动子分别驱动GUS的植物融合表达载体.番茄叶片染色结果显示转化后的番茄叶片均被染成蓝色,表明克隆的番茄8个S1U6启动子均具有转录活性.选择S1U6-2P4为启动子驱动sgRNA,成功构建番茄白粉病相关基因ML01和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,验证结果表明番茄内源启动子S1U6-2P4能有效地驱动sgRNA的转录,并成功实现对番茄内源基因的编辑.内源基因突变的类型都为碱基替换,突变热点仅存在于内源基因靶序列区.[结论]成功克隆了4种在番茄叶片中高效转录的S1U6启动子;基于S1U6-2启动子的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,在番茄中成功实现对内源基因的编辑.
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文献信息
篇名
番茄U6启动子的克隆及CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立
来源期刊
中国农业科学
学科
关键词
CRISPR/Cas9
S1U6启动子
克隆
番茄
基因编辑
年,卷(期)
2018,(2)
所属期刊栏目
园艺
研究方向
页码范围
315-326
页数
12页
分类号
字数
语种
中文
DOI
10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.011
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研究主题发展历程
节点文献
CRISPR/Cas9
S1U6启动子
克隆
番茄
基因编辑
研究起点
研究来源
研究分支
研究去脉
引文网络交叉学科
相关学者/机构
期刊影响力
中国农业科学
主办单位:
中国农业科学院
出版周期:
半月刊
ISSN:
0578-1752
CN:
11-1328/S
开本:
大16开
出版地:
北京中关村南大街12号
邮发代号:
2-138
创刊时间:
1960
语种:
chi
出版文献量(篇)
9193
总下载数(次)
12
相关基金
国家自然科学基金
英文译名:
the National Natural Science Foundation of China
官方网址:
http://www.nsfc.gov.cn/
项目类型:
青年科学基金项目(面上项目)
学科类型:
数理科学
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