苹果U6启动子的克隆及功能分析

• 作者: 丛佩华 卞书迅 张利义 张彩霞 田义 袁高鹏 韩晓蕾
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 苹果 U6启动子 荧光素酶 本氏烟草 愈伤组织
• 年，卷（期）: 2019,（23）
• 所属期刊栏目: 专题:苹果分子生物学
• 页码范围: 4364-4373
• 页数: 10页
• 字数: 5079字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.016

摘要

[目的]U6启动子是CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统中驱动sgRNA转录的重要元件,其可能存在物种特异性因子,且长度不同转录活性存在差异.迄今在苹果(Malus×domestica)上对U6启动子尚缺乏研究.因此,筛选出转录活性高且片段大小合适的苹果U6启动子,可以优化苹果CRISPR/Cas9基因编辑体系.[方法]利用软件DNAMAN以及启动子元件在线分析网站PLACE和plant CARE对苹果U6启动子进行比对分析;克隆并构建U6启动子驱动萤火虫荧光素酶基因(Firefly luciferase,LUC)的融合表达载体,利用农杆菌介导的瞬时转化法分别转染苹果愈伤组织和本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片;通过检测荧光素酶活性对各U6启动子进行转录活性比较.[结果]苹果基因组中共检索到6条U6 snRNA(E-value<3e-40),分别位于第6、7、9、10、15和17号染色体上,取5′端27 bp snRNA及其上游1500 bp作为候选U6启动子.序列比对结果显示,苹果U6启动子与拟南芥相同,均具有两个保守的元件,包括上游序列元件(Upstream sequence element,USE)和TATA-Like box.瞬时转化后荧光素酶活性检测结果显示,10号染色体上的U6启动子转录活性最高,10号染色体上5′端截短的U6启动子(长度分别为1500、959、275和116 bp)中275 bp的启动子活性最强.另外,在苹果愈伤组织中,苹果U6启动子的转录活性要显著高于拟南芥U6启动子.[结论]从苹果基因组克隆6条U6启动子,并筛选出一条转录活性高且片段长度较短的U6启动子.